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研究目的:海藻-甘草反药组合出自“十八反”中的“藻戟遂芫俱战草”,属于配伍禁忌,2015版《中华人民共和国药典》中标明,海藻与甘草不宜同用,但对于其“反”的内在本质,历代医者争议颇多。为了进一步探索海藻-甘草反药组合致毒增毒的科学内涵,本研究分别从心、肝和肾毒性角度出发,探究海藻-甘草“反”的物质基础,为海藻-甘草的临床用药提供科学依据。研究方法:本论文分为五章:第一章是文献综述。第二章建立了 RP-HPLC法同时测定甘草中甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素和甘草酸(GL)的含量。对甘草药材进行质控,选择符合药典标准的甘草药材;比较甘草单煎和海藻-甘草合煎后,甘草中甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素和甘草酸的含量的变化。第三章对海藻-甘草配伍前后多次给药的毒性进行初步探索。大鼠随机分为空白组,低、中和高剂量的海藻组、甘草组和海藻-甘草配伍组,经过连续灌胃给药4周,比较各组间脏器系数及血清中ALT(丙氨酸氨基转移酶),AST(天门冬氨酸氨基转移酶),T-BIL(总胆红素),ALP(碱性磷酸酶),CK(肌酸磷酸激酶),HBDH(羟丁酸脱氢酶),LDH(乳酸脱氢酶),T-CHO(总胆固醇),TG(甘油三酯),GLU(血糖),CRE(肌酐)和BUN(尿素氮)水平的变化,并对心脏、肝脏和肾脏组织进行病理组织学检查。第四章在毒性剂量下研究海藻对甘草中主要活性成分在正常大鼠体内过程的影响。第一节建立了 UPLC-TQ/MS法同时检测大鼠血浆中甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、甘草酸和甘草次酸(GA)的含量,并进行单次及多次给药的毒代动力学研究。第二节建立了 UPLC-TQ/MS法同时检测组织中的甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、甘草酸和甘草次酸的浓度,探究上述成分在心脏、肝脏和肾脏组织的蓄积情况。第五章对海藻-甘草配伍致毒增毒的毒效物质基础及机制进行初步探索。第一节体外实验以MTT法比较含药血清、提取物及甘草次酸对大鼠原代心肌细胞存活率的影响,检测细胞上清液中CK的变化,初步探寻海藻-甘草配伍致心脏毒性的毒效物质基础。第二节应用western blot法检测毒性剂量下多次给药后的大鼠肝脏组织中PPAR-α、PCK1、G6PC蛋白表达水平的变化,体外实验以MTT法比较含药血清、提取物及甘草酸、甘草次酸对人正常肝细胞存活率的影响,初步探寻海藻-甘草配伍致肝脏毒性的毒效物质基础及致毒机理。第三节放免法检测毒性剂量下多次给药后的大鼠血清中醛固酮和皮质醇含量,应用western blot法检测肾脏组织中HSD11B2蛋白表达水平的变化,体外实验以MTT法比较含药血清、提取物及甘草酸、甘草次酸对HK-2细胞存活率的影响,初步探寻海藻-甘草配伍致肾脏毒性的毒效物质基础及致毒机理。研究结果:1.海藻-甘草按1:1配伍后,合煎剂中甘草的主要活性成分的溶出发生了变化,其中甘草苷含量降低了 12.29%,异甘草素和甘草酸分别增加了 13.60%和10.53%,而异甘草苷和甘草素含量无明显变化。2.低剂量(临床剂量)海藻、甘草和海藻-甘草合用组均未发现明显毒性反应;海藻-甘草合用高剂量组心脏、肝脏和肾脏脏器系数明显高于空白对照组(P＜0.01-0.05),血清中ALT,AST,ALP,CK,HBDH,LDH,TG,GLU,BUN 明显升高(P＜0.01-0.05)，中、高剂量海藻组和海藻-甘草组心脏均出现不同程度的炎性细胞浸润,其中高剂量合用组大鼠出现严重的心肌细胞坏死。中、高剂量的甘草组和海藻-甘草组的肝组织出现不同程度的炎性反应及水样变性,合用组病变程度明显加重。中、高剂量甘草组大鼠的肾小管周围出现轻、中度炎性细胞浸润和轻度蛋白管型。中、高剂量海藻-甘草组大鼠的肾小管周围有炎性细胞浸润,壁层上皮细胞增生及蛋白管型。3.在单次、多次的毒代动力学研究中发现,海藻增加了甘草中活性成分甘草次酸Cmax和AUC(P＜0.01-0.05),从而增加甘草次酸血浆暴露程度。高剂量海藻-甘草组大鼠的心脏、肝脏和肾脏中的GA蓄积水平明显高于甘草组(P＜0.01-0.05),较之甘草组分别增加了约114%,19%,190%;高剂量海藻-甘草组中甘草苷在心脏中的暴露明显低于甘草组(P＜O.05),在肝脏和肾脏中也呈下降趋势。4.体外实验证明甘草次酸能降低大鼠原代心肌细胞存活率、升高细胞上清中CK水平,表明甘草次酸具有明显的体外心肌细胞毒性。毒性剂量下多次给药后甘草组、海藻-甘草组大鼠肝脏组织中PPAR-α表达下调(P＜0.05-0.01),PPCK1、G6PC蛋白表达水平上调(P＜0.05-0.01),体外实验证明甘草次酸、甘草酸均可降低L02细胞存活率,提示甘草次酸、甘草酸具有明显的体外肝细胞毒性。毒性剂量下多次给药后,高剂量甘草组、海藻-甘草组大鼠血清中醛固酮水平降低(P＜0.01-0.05),高剂量海藻-甘草组皮质醇水平升高(P＜0.05-0.01)。甘草组、海藻-甘草组大鼠肾组织中HSD11B2蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05-0.01),合用组作用更显著。体外实验证明甘草次酸能降低大鼠HK-2细胞存活率,表明甘草次酸具有明显的体外肾细胞毒性。研究结论1.海藻-甘草合煎后甘草酸的溶出度显著升高,提示甘草酸有可能参与海藻-甘草配伍致毒增毒。2.多剂量给药毒性评价结果表明,心脏、肝脏和肾脏可能是海藻-甘草配伍致毒增毒的主要毒性靶器官。3.毒性剂量下,海藻显著增加甘草的主要活性代谢产物甘草次酸在血浆中的暴露水平及心脏、肝脏和肾脏中的蓄积程度,推测甘草次酸可能是海藻-甘草配伍致毒增毒的主要毒效物质基础之一。4.体外细胞实验结果表明,甘草次酸具有明显的体外心、肝、肾细胞毒性,提示甘草次酸可能是海藻-甘草配伍致毒增毒的主要毒效物质基础之一。海藻通过增加甘草次酸在大鼠肾脏组织的积蓄,抑制肾脏组织中的HSD11B2的表达,造成电解质及醛固酮-皮质醇系统紊乱,可能是海藻-甘草反药组合产生肾毒性的主要机制之一。