研究背景和目的结肠癌转移相关基因1(metastasis associated in colon cancer-1, MACC1)最早是在结肠癌中发现其为癌基因,与结肠癌的转移和预后相关。MACC1是肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)/肝细胞生长因子受体(Met tyrosine kinase receptor, c-Met)信号传导通路的重要调节因子。c-Met基因是上世纪80年代发现的一个癌基因,HGF是c-Met受体唯一的配体,当其表达异常时,HGF与c-Met受体结合后激活RAS-有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MARK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)-丝氨酸/苏氨酸激酶(Serine/threonine kinase, Akt)、信号传导及转录激活因子(Signal transducers and activators of transcription, STAT)信号传导通路,发挥促细胞增殖、侵袭、血管生成和抗凋亡等功能,与包括结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌在内的多种恶性肿瘤发生及预后相关。MACC1基因位于7号染色体上(7p21.1),含有七个外显子和六个内含子,其cDNA含2559个核苷酸,编码的蛋白含852个氨基酸残基。MACC1基因与肿瘤转移的相关性首先由Stein等在结肠癌中被发现,MACC1高表达的患者术后转移发生的时间短于低表达的患者,是影响结肠癌转移和无转移生存时间长短的独立因素；MACC1表达对结肠癌患者预后也有影响,低表达的患者五年生存率高达80%,而MACC1高表达的患者五年生存率仅15%；此外,基于无远处转移患者结肠癌原发灶MACC1的表达情况,其在预测发生异时性转移和未发生异时性转移的结肠癌患者准确率高达74%和80%,可有效地预测结肠癌转移；在构建的结肠癌细胞株中,MACC1高表达的细胞运动力和增殖力明显高于干扰MACC1表达组；在异种移植的小鼠模型中也发现,MACC1明显促进肿瘤的生长和转移。随后,更多的研究支持stein等人的观点,发现MACC1与结直肠癌的TNM分期、腹膜转移也具有相关性,其表达在Ⅳ期患者中明显高于Ⅰ-Ⅲ期患者,在发生腹膜转移的患者中也明显高于未发生腹膜转移者。在肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌等恶性肿瘤中也发现,MACC1可影响癌症患者的预后或术后复发,可促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。在胃癌方面,关于MACC1的作用了解甚少。近期一项临床研究表明,MACC1在胃癌发生腹膜转移的患者中表达量比未发生转移的患者更高。目前,在全球恶性肿瘤中死亡率排名第二位的胃癌,外科手术仍然是其治愈的唯一方式,但即使行根治性切除术后仍有约一半的患者会面临肿瘤复发,而肿瘤一旦发生复发,则严重影响患者的预后。在发生术后复发的患者中,其中有很大一部分是因为出现了血行和腹膜转移,其原因可能是在术前肿瘤细胞就已经发生了不可察觉的微转移。人们普遍认为上皮-间质转变(epithelial-to-mesenchymal, EMT)是肿瘤细胞发生侵袭和转移的非常重要的因素。EMT发生过程是肿瘤细胞发生从上皮细胞表型到间质细胞表型的转化,从细胞间连接和周围基质的束缚中脱离出来,形成单个的肿瘤细胞,从而侵袭周围组织,发生远处转移。目前公认的与EMT发生相关的分子标志包括：间质表型相关基因表达上调,如波形蛋白(vimentin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)、纤连蛋白(Fibronectin)、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-9等；上皮表型相关基因表达下调,如E-钙粘蛋白(E-cadherin)、桥粒斑蛋白(desmoplakin)、细胞角蛋白(cytokeratin)等。诱导EMT发生的机制涉及多条信号传导通路,而且各通路之间相互影响,关系错综复杂。HGF、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDF)可通过酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinases, RTK)激活Ras-Raf-MAPK信号通路,或作用于PI3K、Src-STAT信号通路而作用于EMT。转化生长因子(ransforming growth factor、TGF)-β通过丝氨酸/酪氨酸激酶受体(receptor serine/threonine kinases, RS/TK)激活R-Smad/Co-Smad通路,或作用于P13K和MARK通路,TGF-β受体信号通路也可直接作用于极性蛋白Par6,抑制Rho的表达,导致上皮细胞间紧密连接松解；Wnt配体信号通路也是调控EMT的重要途径之一,它可与跨膜受体结合,作用于p-连环蛋白(β-catenin)和转录因子LEF-1/TC而作用于EMT。这些信号通路都可调控EMT相关基因的而导致EMT的发生和细胞运动性改变。在结肠癌中已证实,MACC1是c-Met基因的上游转录激活因子,可调控HGF/c-Met信号通路,而HGF/c-Met信号通路可促进胃癌的发生和转移,同时,该信号通路失调也可诱导EMT的发生。因此,MACC1是否与胃癌的术后复发相关,是否通过调控EMT的发生而改变胃癌的恶性生物学行为?我们下面的研究将致力于解决这些疑问。在本篇研究中,我们首先回顾性研究264例Ⅰ-Ⅲ期已行胃癌根治手术的患者资料,分析MACC1对胃癌根治术后复发的影响,及其表达与患者临床病理学参数之间的关系；其次,在体外细胞实验中研究MACC1表达水平改变对胃癌细胞侵和迁移能力的影响,并进一步探索其是否通过调控EMT发生而影响胃癌的恶性生物学行为。研究方法1.检测Ⅰ-Ⅲ期行胃癌根治性切除手术患者的癌组织标本中MACC1蛋白的表达情况,并分析其临床意义。收集2004至2008年在南方医院行胃癌根治性切除手术的患者共264例,所有患者均经病理诊断为胃癌,并达到R0切除。根据2010年第7版AJCC胃癌分期标准进行分期。随访患者从手术到肿瘤复发的时间,随访截止时间为2011年3月。取患者手术癌组织标本进行石蜡包埋,将癌组织石蜡块制成4mm厚的石蜡切片,用免疫组织化学的实验方法检测MACC1蛋白表达,根据染色范围和染色深浅进行评分,结合患者的临床病理学特征,统计分析MACC1表达高低是否与胃癌患者术后复发及复发时间长短有所关联。这种关联是否受年龄、性别、分期等影响。2.构建MACC1过表达及沉默稳转人胃癌细胞株根据MACC1基因序列,设计扩增或干扰MACC1表达的质粒,将质粒转染逆转录病毒,感染BGC-823、MKN-28人胃癌细胞株,构建MACC1过表达细胞(MACC1),对照空载细胞(vector), MACC1沉默细胞(shMACC1),对照无关序列细胞(scramble)。采用荧光实时定量(Real-time, RT) PCR和Western blot方法检测细胞株中MACC1的mRNA及蛋白含量,鉴定是否成功构建MACC1过表达及沉默的稳转细胞株。3.检测MACC1表达改变对胃癌细胞株侵袭和迁移的影响。采用Transwell实验方法比较MACC1不同表达水平的稳转细胞之间侵袭能力的差异,采用划痕实验比较迁移能力的差异。4.检测MACC1表达水平改变对EMT相关基因表达的调控。采用RT-PCR和Western blot实验方法检测MACC1不同表达水平的稳转细胞EMT相关基因的表达情况,包括E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、纤连蛋白、MMP2、 MMP9、波形蛋白、CD44基因的mRNA和蛋白含量。5.统计学方法所以结果都应用SPSS16.0软件进行统计学处理。MACC1蛋白表达与胃癌患者术后无疾病进展生存(Disease free survival,DFS)时间关系用Kaplan-Meier法,MACC1蛋白表达与临床病理学参数(性别、年龄、肿瘤分期、患者复发状态)之间的关系用x2检验。风险比(Hazard ratio, HR)用Cox模型计算。PCR及Western blot结果采用Student’s-T检验。所有P值<0.05被认为有统计学差异。研究结果1. MACC1在胃癌患者癌组织中的表达(1)在264例胃癌患者中,75.4%的患者癌组织MACC1表达阳性,24.6%表达阴性。(2) MACC1表达与患者性别(P=0.266)、年龄(P=0.446)无关,与临床分期相关。在Ⅰ期患者中,MACC1表达阳性率为62.8%,但Ⅱ-Ⅲ期患者中阳性率达77.8%,两者间的差异有统计学意义(P=0.036)。(3) MACC1与胃癌患者术后复发相关,其中在发生复发的患者中,84.2%的患者MACC1表达阳性,在未发生复发的患者中,MACC1表达阳性占60.6%,P<0.001,有统计学差异。(4) MACC1表达阳性胃癌患者术后DFS明显短于表达阴性患者,尤其在Ⅱ-Ⅲ期的患者中,MACC1是影响胃癌DFS的独立因素。2. MACC1促进胃癌细胞的侵袭和迁移与对照组相比,MACC1过表达组细胞通过Transwell小室的细胞数量更多,MACC1沉默组细胞通过Transwell小室的细胞数量则较少,表明MACC1表达量越高,胃癌细胞侵袭能力越强。在划痕实验中,MACC1过表达组细胞向划痕边缘爬行速度最快,划痕宽度明显变窄,而MACC1沉默组细胞向划痕边缘爬行速度最慢,残留的划痕宽度最宽,表明MACC1表达越高,胃癌细胞迁移能力越强。3. MACC1可调控EMT相关基因的表达与对照组相比,MACC1过表达组细胞上皮细胞标志E-钙粘蛋白、α-连环蛋白mRNA和蛋白含量较低,间叶转化相关的纤连蛋白、波形蛋白、MMP2、MMP9、 CD44的mRNA和蛋白含量明显升高；MACC1沉默组细胞的结果则与之相反,统计分析P值均<0.05,具有统计学差异。研究结论1.MACC1与胃癌根治术后患者分期及复发相关,可促进胃癌术后复发,缩短复发时间,是胃癌术后复发的独立危险因素。2.MACC1可促进胃癌细胞的侵袭和迁移。3.MACC1可能是通过调控EMT的发生而影响胃癌的恶性生物学行为。