2006年8月,Yamanaka小组将24种转录因子基因排列组合导入小鼠成纤维细胞,最终确定最少有4种转录因子组合——3ct4、Sox2、c-Myc和Klf4即可将成纤维细胞重编程为诱导性多潜能干(iPS)细胞,2007年11～12月,Yamanaka小组和Thomson小组先后将人的体细胞重编程为iPS细胞。这之后iPS细胞的研究和关注度呈爆炸式增长,且取得了一些突破性进展,如建立了疾病特异的人iPS细胞、借助转座子介导的转基因方法高效制备了virus-free iPS细胞以及成功地从所获得的iPS细胞中移除先前导入的转录因子基因。在利用特定小分子化合物的情况下,更少的外源基因导入即可高效率获得iPS细胞,这向制备无遗传修饰的iPS细胞方面迈出了一大步；此外,亦建立了大鼠和猴等的iPS细胞系,这些成绩将iPS细胞在临床上的实际应用又大大向前推进了一步,iPS细胞研究和应用将有望成为21世纪最伟大的医学生物学成就之一。研究肿瘤细胞重编程的经典方法有：①利用胚胎微环境,②囊胚腔注射,③利用胚胎干细胞生长微环境。iPS细胞技术的问世为研究肿瘤细胞重编程提供了一种新的思路和手段。利用Oct4、Sox2、C-myc和Klf4即可将肿瘤细胞重编程,2009年7月Hochedlinger课题组用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4将小鼠黑色素瘤细胞重编程为iPS细胞。iPS技术为在体外研究肿瘤细胞重编程提供了重要的技术平台,为研究肿瘤发病机制及肿瘤治疗等方面提供一种新思路。本课题借助慢病毒基因投递法将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种基因导入人皮肤成纤维(CCD)细胞,进而将其重编程为iPS细胞,从而实现以下目的：①为体外研究肿瘤细胞重编程构筑技术平台；②为后续研究[如iPS细胞生物学特性和行为(如自我复制、增殖和分化等)调控机制研究]奠定基础。目的：借助慢病毒载体法将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种基因导入CCD细胞,进而将其重编程为iPS细胞,以实现多种目的(见上)。方法：1)携带Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4基因的慢病毒载体鉴定酶切鉴定分别用BamHⅠ/KpnⅠ和EcoRⅠ/EcoRⅤ进行酶切,酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。PCR鉴定根据Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2序列设计引物分别扩增Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2基因；PCR扩增后,取5μl反应液进行2%琼脂糖凝胶电泳。2)慢病毒生产与滴度测定慢病毒包装按标准程序进行慢病毒包装(脂质体介导的转染)。慢病毒滴度测定用5μl病毒上清感染15万293T细胞,48h后4%多聚甲醛固定,DAPI染色,荧光显微镜下计数EGFP阳性细胞和总细胞数,将其带入公式：病毒滴度(IU/ml)=EGFP阳性细胞数／总细胞数÷5×1.5x105×103。3)慢病毒载体法重编程CCD细胞为iPS细胞a)取一定量的病毒上清过滤后悬浮感染CCD细胞。b)病毒感染24小时后,将CCD细胞消化铺于feeder细胞上,换为hES细胞培养基,第十天开始换为条件培养基。c)20天左右开始挑取克隆,选择AP阳性细胞继续后续工作。4)人iPS细胞建系及其生物学特性鉴定a)iPS细胞克隆形态观察；b)细胞免疫荧光检测人ES细胞标志性抗原表达；c)提取iPS细胞总RNA,进而RT-PCR检测人ES细胞标志性基因表达；d)人iPS细胞核型分析；e)悬浮培养观察拟胚体形成及体外分化；f)iPS细胞接种至SCID小鼠皮下,观察畸胎瘤形成及体内分化情况。结果：1)携带Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4基因的慢病毒载体鉴定酶切鉴定携带Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4基因的慢病毒载体分别经BamH I/KpnⅠ和EcoRⅠ／EcoRⅤ酶切,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳均可见两条预期大小的条带。PCR鉴定分别以携带Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4基因的慢病毒载体为模板,扩增Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2基因,PCR产物大小均与预期值相符。2)慢病毒生产与滴度测定携带Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4基因的慢病毒载体与病毒包装质粒共转染293T细胞,24h后倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,预示转染成功。按照上述.方法进行慢病毒滴度测定,病毒滴度值都在1×106IU/ml以上。3)慢病毒载体法重编程CCD细胞为iPS细胞用携带Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4基因的慢病毒感染CCD细胞,24h后种植于饲养层(feeder)细胞上,并换为hES细胞培养基,48-72h在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光,第十天左右开始换为条件培养基。4)人iPS细胞建系及其生物学特性鉴定a)第7-8天可见CCD细胞形态发生变化,由长梭形变为圆形并聚集；第20天左右挑取克隆；b)其中只有1株iPS细胞AP染色呈阳性,且具有典型的hES细胞克隆形态；c)1株人iPS细胞系表达hES细胞特有的标志性基因；d)1株人iPS细胞系表达hES细胞特有的标志性抗原：SSAE-4(+), TRA-1-60(+),TRA-1-81(+),Oct4(+),SSAE-1(-)；e) 1株人iPS细胞核型分析未见异常；f) 1株人iPS细胞系具有体外分化形成囊性拟胚体的能力,并能表达各胚层的标志性基因；g)畸胎瘤实验目前还在进行中。结论：1.运用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种基因成功将CCD细胞重编程为iPS细胞。2.1株人iPS细胞系具有人ES细胞的一些生物学特,且在体外长期传代中能够维持此特性,初步证明建立了人iPS细胞系。