研究背景:垂体腺瘤是常见的原发性颅内肿瘤,根据激素分泌情况,垂体腺瘤可分为功能性腺瘤和临床非功能性(nonfunctioning,NF)腺瘤。催乳素腺瘤、生长激素(growth hormone,GH)分泌腺瘤、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)分泌腺瘤以及NF腺瘤是垂体腺瘤最常见的四种亚型。虽然是良性肿瘤,但它们会引发颅内占位效应,功能性腺瘤还会显著干扰体内激素水平。在四种最常见的垂体腺瘤亚型中,与库欣病(分泌ACTH)、肢端肥大症(分泌GH)和NF腺瘤相关的肿瘤亚型通常采用经蝶窦手术作为一线治疗。然而,由于部分垂体腺瘤可能侵犯颈内动脉海绵窦或鞍区周围骨质,有时很难实现肿瘤全切除。且手术难以避免会带来新的风险。除催乳素腺瘤外,现有药物治疗往往作为手术治疗的补充。这些药物同时具有抗激素分泌和抗肿瘤的效果,大多数催乳素腺瘤对卡麦角林等多巴胺受体激动剂敏感,然而,肢端肥大症和库欣病对奥曲肽和帕瑞肽等生长抑素类似物类药物反应差异较大。并且这些药物通常需要长期服用,并需要定期监测生化控制程度及副反应。放射治疗也是手术后残余肿瘤以及复发肿瘤或无法手术患者的一个选择,但是放疗有可能会对垂体腺瘤周围正常组织,如视神经等造成损伤。因此,寻找新的治疗垂体腺瘤的方法仍是目前的临床重点。代谢异常被认为是肿瘤细胞的特征之一。虽然垂体腺瘤是良性肿瘤,但也有证据表明存在代谢重构。几项研究通过代谢组学分析或核磁共振波谱分析证实了垂体腺瘤与正常垂体之间或不同肿瘤亚型之间代谢物的差异。我们之前报道过乳酸脱氢酶A是糖酵解的关键酶,在侵袭性垂体腺瘤中高表达,是一个潜在的治疗靶点。然而,尽管代谢物发生了变化,但具体的治疗靶点通常是代谢相关酶。这些酶的表达水平改变代谢流,可以在转录水平上检测到。丰富的转录组学数据使我们能够系统地研究肿瘤的各种代谢重组。然而到目前为止还没有任何关于垂体腺瘤发生发展的代谢相关基因和潜在的机制的组学研究。研究方法:在基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus database,GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中搜索“pituitary”“pituitary adenoma”“pituitary tumor”“prolactinoma”“growth hormone”and“Cushing disease”,检索人垂体腺瘤可下载原始芯片数据。经过标准化处理并移除批次效应后,我们将四种肿瘤亚型的基因表达数据分别与正常对照相比,得出四种亚型的差异表达基因。随后用维恩图找出其重叠部分,进而得到各肿瘤亚型所特有的差异表达基因。随后对这些亚型肿瘤特异性差异表达基因进行GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)功能富集,并找出其中与代谢相关的通路以及参与其中的差异表达基因。最后建立人蛋白-蛋白互作网络进一步阐明代谢相关差异表达基因与其他差异表达基因直接的相互作用关系。结果:1.整合基因芯片数据并识别差异表达基因1.1我们从GEO数据库得到9个垂体腺瘤基因表达数据集,其中共有160例标本信息,包括52例ACTH腺瘤,38例GH腺瘤,40例NF腺瘤,9例PRL腺瘤以及21例正常垂体.1.2 GH垂体腺瘤与正常垂体相比有512个差异表达基因,ACTH垂体腺瘤有392个差异表达基因,PRL垂体腺瘤有1581个差异表达基因,NF垂体腺瘤有1149个差异表达基因。2.亚型特异性差异表达基因的识别及KEGG通路分析2.1利用维恩图发现分泌ACTH的垂体腺瘤有0个特异性差异表达基因,分泌GH的垂体腺瘤有22个特异性差异表达基因,分泌PRL的垂体腺瘤有1081个特异性差异表达基因,NF垂体腺瘤有437个特异性差异表达基因,在四种亚型所共有的217个差异表达基因,我们称之为共有差异表达基因。2.2 PRL垂体腺瘤特异性差异表达基因主要富集在破骨细胞分化、弓形虫病、炎症性肠病和凋亡通路。NF垂体腺瘤特异性差异表达基因主要富集在鞘糖脂合成、c AMP信号通路、蛋白酶体和含血清素的神经突触通路。共有差异表达基因主要富集在PI3K-Akt信号通路,细胞外基质-受体相互作用、TGF-β信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。此外,我们注意到PRL和NF垂体腺瘤特异性差异表达基因富集到的前20个KEGG通路中,分别有6个和7个代谢相关通路。3.代谢相关的KEGG通路和GO条目分析3.1共有差异表达基因仅在两种KEGG代谢途径中富集:细胞色素P450对外源生物的代谢和硫代谢。GO条目富集到葡萄糖稳态和维甲酸代谢过程。3.2 PRL垂体腺瘤特异性差异表达基因富集到了6个代谢相关KEGG通路:磷酸戊糖途径,果糖和甘露糖代谢,脂肪酸降解、色氨酸代谢、丙氨酸代谢和碳代谢。3.3 NF垂体腺瘤特异性差异表达基因富集到了12个代谢相关KEGG通路:类固醇生物合成,精氨酸生物合成,嘌呤代谢,半胱氨酸和蛋氨酸代谢,酪氨酸代谢,粘多糖生物合成-肝素/肝素,花生四烯酸代谢,代谢亚油酸,亚麻酸的新陈代谢,鞘糖脂合成,泛酸盐和辅酶a生物合成,硫代谢。4.蛋白-蛋白相互作用(Protein–protein interaction,PPI)网络的建立及分析共有差异表达基因的PPI网络中PDK4和PCK1是与其他人蛋白质连接(网络度)最多的两个代谢酶。不仅如此,PDK4还连接到网络中的一个枢纽蛋白STAT5b。PRL特异性差异表达基因的PPI网络富集在乙酰辅酶A、核苷酸合成以及γ-氨基丁酸和5-羟色胺的生成反应,其中介导生成γ-氨基丁酸的谷氨酸羧化酶(glutamate decarboxylase 1,GAD1)与NF特异性差异表达基因PPI网络中的谷草转氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase 1,GOT1)涉及两种不同的谷氨酸代谢通路。结论:1.我们识别了不同垂体腺瘤激素亚型特异性表达的差异基因,并发现这些基因富集到数个代谢相关通路中。2.细胞色素P450对外源物质的代谢,硫代谢,葡萄糖稳态和维甲酸代谢过程在四种垂体腺瘤亚型中都有异常。PDK4和PCK1可能是垂体腺瘤中共有的潜在代谢相关关键分子和治疗靶点。3.PRL和NF垂体腺瘤均存在谷氨酸代谢以及糖异生、转氨基、脂质代谢、和核苷酸代谢等代谢异常。研究背景:第一部分研究结果提示在垂体腺瘤中谷氨酸相关的代谢通路可能存在异常变化。正常生理条件下,谷氨酸与有毒性的游离铵离子结合生成谷氨酰胺再转运到各处组织,然而在肿瘤细胞中大量谷氨酸的存在被认为是细胞摄取外源性谷氨酰胺之后分解所得。谷氨酰胺是人体含量最多的一种氨基酸,正常生理状态下可以由谷氨酸和铵离子在体内合成,因此是一种非必须氨基酸。然而,大多数癌症细胞在没有谷氨酰胺的培养环境下无法生存,这个现象被称为“谷氨酰胺依赖”现象。对于一些癌症细胞来说,谷氨酰胺是重要的能量来源,并且是很多大分子物质的合成前体,比如氨基酸、蛋白、脂质和核苷酸等。因此,谷氨酰胺缺乏会造成代谢压力并导致癌症细胞凋亡并不奇怪。以谷氨酰胺转运体或者谷氨酰胺分解酶为治疗靶点已在多项研究中被证实能有效抑制肿瘤细胞生长。代谢异常已被公认为是癌症的特质之一,较普遍的变化有“Warburg效应”和“谷氨酰胺依赖”两个现象。沃伯格效应是指癌症细胞即使在氧气充足的环境下依然优先进行无氧糖酵解的现象。虽然绝大多数垂体腺瘤是良性肿瘤,我们在前期研究中发现糖酵解关键酶乳酸脱氢酶A在垂体腺瘤的发生与发展中发挥重要作用,也证实了乳酸脱氢酶A有希望成为潜在的垂体腺瘤治疗靶点。垂体腺瘤是否存在“谷氨酰胺依赖”目前尚无研究报到。虽然已有研究通过磁共振波谱分析或者代谢组学的方法报道了谷氨酰胺或谷氨酸代谢在垂体腺瘤与正常组织或者在不同亚型的垂体腺瘤中存在差异。但是,谷氨酰胺在垂体腺瘤的病理生理过程中发挥怎样的作用目前仍是未知。研究方法:At T20,MMQ和GH3细胞在有或无谷氨酰胺环境下培养,用CCK-8方法检测细胞增殖进而得出三种细胞的生长曲线。左旋天冬酰胺酶可以清除培养基中的谷氨酰胺,因而被当做另一种方法证实去除谷氨酰胺对垂体腺瘤细胞的影响。然后我们检测了三种细胞系以及6例原代细胞在有/无谷氨酰胺环境下GS酶的表达情况。随后,用免疫组化方法检测了24例垂体腺瘤手术标本中GS酶的表达情况,包括5例生长激素腺瘤,5例ACTH腺瘤,5例PRL腺瘤和9例NF腺瘤。使用小干扰RNA或药物阻断GH3细胞GS酶,用流式细胞技术检测凋亡细胞数和细胞周期分布。最后用液相色谱质谱仪检测谷氨酰胺剥夺后GH3细胞内代谢物含量的变化。研究结果:1.GS表达水平决定垂体腺瘤细胞对无谷氨酰胺环境的敏感性1.1三种垂体腺瘤细胞系对去除外源性谷氨酰胺敏感性不同,GH3细胞基本不受影响,MMQ和At T20细胞的增殖分别被抑制了64%和20%。1.2 GH3细胞的GS酶蛋白表达水平显著高于MMQ和At T20细胞(p<0.001),并且,去除外源性谷氨酰胺后,GH3细胞和At T20细胞的GS酶蛋白表达水平都显著升高,但是MMQ细胞没有显著变化。1.3 6例原代细胞有5例也在去除外源性谷氨酰胺后,GS酶蛋白表达水平都显著升高。1.4与对照组相比,小干扰RNA敲低GS的GH3细胞对去除外源性谷氨酰胺更敏感,但在完全培养基环境下无明显区别。1.5)联合左旋天冬酰胺酶和MSO可以抑制所以细胞系的增殖。2.人垂体腺瘤标本中GS的表达情况2.1我们将GS染色后免疫组化结果进行评分并从低到高划分为四个等级,统计结果表明大多数(87.5%)的人垂体腺瘤标本表达GS,只有3例基本不表达(评分为最低等级)。2.2 p53阳性和ki-67指数大于3%与更高的GS表达水平正相关。2.3生长激素腺瘤GS表达水平最高,与细胞系结果相同。3.对表达GS的GH3细胞同时阻断内源性和外源性谷氨酰胺,会阻碍核苷酸代谢和细胞周期进程3.1我们选择GH3细胞代表表达GS的细胞,同时阻断内源性和外源性谷氨酰胺不会诱导GH3细胞死亡,在谷氨酰胺饥饿三天后GH3细胞生长停滞,当是当再次补充谷氨酰胺后,GH3细胞可以重新增殖。3.2同时阻断内源性和外源性谷氨酰胺没有增加凋亡的GH3细胞,但是使细胞周期停滞在了S期。3.3同时阻断内源性和外源性谷氨酰胺后,谷氨酰胺参与补缺的下游代谢物α-酮戊二酸、琥珀酸和延胡索酸含量没有明显变化。3.4同时阻断内源性和外源性谷氨酰胺后,合成核苷酸的中间产物肌苷单磷酸(IMP)、脱氧胞苷三磷酸(d CTP)、脱氧胞苷单磷酸(d CMP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸腺苷(ATP),鸟苷二磷酸(GDP)等代谢物含量显著降低。3.5变化代谢物的KEGG通路富集也表明嘌呤和嘧啶代谢途径是变化最显著的通路。3.6 d CTP回补部分挽救了谷氨酰胺饥饿引起的增殖阻滞。结论:1.垂体腺瘤细胞适应无谷氨酰胺环境需要GS酶的存在2.大部分垂体腺瘤细胞表达GS,且p53阳性和ki-67指数大于3%与更高的GS表达水平正相关。3.表达GS的垂体腺瘤细胞在左旋天冬酰胺酶和GS抑制剂联合作用下,核苷酸合成和细胞周期进展会受阻,进而细胞增殖被抑制。