论文部分内容阅读
神经病理性疼痛是由中枢或外周神经系统病变等引起的慢性疼痛,其特征性的临床表现有疼痛过敏、异常疼痛和自发痛等。这种慢性疼痛往往影响了患者的生活质量,并带来沉重的精神、心理及经济负担。目前临床上总体疗效不佳。阐明疼痛的产生机理对于发展新的镇痛药物和治疗方法是必不可缺的。近年研究报道,背角小胶质细胞在神经病理性疼痛的发生和维持中起着重要作用。激活的脊髓背角小胶质细胞可以通过释放一些细胞因子和趋化因子促进伤害性信息的传递。P2Y13受体表达于背角小胶质细胞,但P2Y13受体是否可以通过调节脊髓背角小胶质细胞的活性,参与脊髓水平痛觉信息的整合尚有待研究。本课题拟在以往本实验室对嘌呤 P2受体研究的基础上,制作大鼠坐骨神经痛模型,分别采用在体和离体两方面研究,综合应用行为学、形态学、分子生物学方法,观察记录:1)P2Y13受体阻断前后,坐骨神经缩窄性损伤后大鼠的行为学变化;2)P2Y13受体阻断前后,脊髓背角小胶质细胞功能变化;3) P2Y13受体阻断对于ADP诱发背角小胶质细胞Ca2+变化的影响。本课题从不同角度探讨P2Y13受体对小胶质细胞功能的影响,这将有助于为病理性疼痛的机理研究提供新的思路,为以小胶质细胞为靶点开发新型镇痛药提供理论基础。 目的:1.明确脊髓背角P2Y13受体是否参与CCI大鼠神经病理性疼痛。 2.明确P2Y13受体是否可以促进脊髓背角小胶质细胞胞浆内Ca2+浓度上调。 方法:实验所用动物均购置于第三军医大学实验动物中心。 (1)健康成年雄性SD大鼠随机分为3组(n=8): sham组、CCI模型组(鞘内注射生理盐水)、MRS2211(P2Y13受体拮抗剂)处理组(CCI+鞘内注射100pmol/L MRS2211)。CCI模型组及MRS2211处理组大鼠均于鞘内置管7d之后建立坐骨神经缩窄性损伤模型(CCI),连续14d鞘内注射生理盐水或MRS2211(100pmol/L),2次/d,分别在术前1d、术后第1,3,5,7,10,14d测定给药1h后热缩足潜伏期(TWL);分别在第7,14d处死大鼠,取脊髓背角做免疫印迹,观察背角P2X4受体和P38MAPK表达变化。 (2)培养纯化新生SD大鼠脊髓背角小胶质细胞,免疫组化观察P2Y13受体表达,激光共聚焦显微镜检测ADP作用下,小胶质细胞[Ca2+]i的变化;随后观察MRS2211、MRS2179、MRS2395预处理对于ADP诱发小胶质细胞Ca2+动员的影响。 结果:(1)CCI术后1d大鼠即可形成稳定的热痛敏,与sham组相比,CCI组大鼠术后第1,3,5,7,10,14d TWL明显缩短(P<0.01);与CCI组相比,MRS2211处理组术后第1,3,5,7,10,14d TWL明显延长(P<0.05)。免疫印迹观察到,与sham组相比,CCI组术后第7d P2X4受体表达上调(P<0.05),在第14d P2X4受体表达上调更为明显(P<0.05);与sham组相比,CCI组术后第7d P38MAPK表达明显上调(P<0.05),在第14d P38MAPK表达有所下降,但与sham组相比仍具有统计学意义(P<0.05);与CCI组相比,MRS2211处理组大鼠术后第7d背角P38MAPK表达上调明显减弱(P<0.05),但在第14d P38MAPK表达有所上升,但与 CCI组相比仍具有统计学意义(P<0.05);此外,鞘内注射 MRS2211并不影响CCI大鼠脊髓背角P2X4受体表达变化。 (2)免疫组化实验观察到,在离体培养的大鼠脊髓背角小胶质细胞表达P2Y13受体,ADP可引起培养的脊髓背角小胶质细胞[Ca2+]i快速增高,且呈现剂量依赖性;P2Y13受体拮抗剂 MRS2211(100μmol/L)可以阻断 ADP的作用,而P2Y1受体拮抗剂MRS2179(100μmol/L)、P2Y12受体拮抗剂MRS2395(100μmol/L)均不影响ADP引起的小胶质细胞[Ca2+] i升高的效应。 结论: 1.鞘内注射P2Y13受体拮抗剂MRS2211可以明显抑制CCI大鼠热痛敏症状,脊髓背角P38MAPK表达下调,但并不影响CCI大鼠P2X4受体表达变化。这提示MRS2211可以抑制小胶质细胞P38MAPK活化但不影响小胶质细胞P2X4受体表达,这可能是其在脊髓水平发挥镇痛作用的机制之一。 2. ADP可能通过P2Y13受体途径,快速增高培养的脊髓背角小胶质细胞[Ca2+]i,并促进小胶质细胞激活。