[研究目的与背景]恶性肿瘤细胞周围环境对细胞本身产生非常重要的影响,可改变其行为和性质,而头颈肿瘤中作为预后较差的喉癌,其癌灶周围的炎性微环境在促进癌细胞生长、浸润和转移中发挥了重要作用。肿瘤周围的炎性微环境状态已成为近来研究肿瘤的热点,许多炎症因子可作为各种恶性肿瘤预后的标志物。最常见的炎性细胞包括巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞等。它们在肿瘤微环境中占有重要比例,对肿瘤有促进或抑制的双重效应。肿瘤细胞不是孤立性生长,而是通过分子信号传导实现了相关之间的联系,因此全面的理解喉癌浸润的生物学行为需要理解其周围炎症微环境中的相关细胞,在炎性微环境中发挥重要作用的是巨噬细胞。肿瘤相关巨噬细胞(Tumor Associated Macrophages,TAMs)促进肿瘤新生血管形成和抑制正常的抗肿瘤免疫反应。近来研究显示癌细胞分子信号传导实现了细胞与细胞之间的分子联系,从而促使肿瘤相关炎性细胞发挥作用,影响了肿瘤的生物学行为。TAMs导致肿瘤分泌更多的细胞因子,从而实现了与间质组织的联系,这一结果导致肿瘤细胞的进一步扩散。TAMs通过与肿瘤组织和细胞的相互作用导致肿瘤组织和细胞分泌许多蛋白水解酶,后者对肿瘤周围基底膜的水解和破坏作用为新生血管的植入和肿瘤细胞的生长和转移提供了可能。TAMs分为截然不同的两种类型:M1和M2,M1型有抗肿瘤活性由微生物产物刺激产生;而M2型有促进肿瘤生长的活性,由IL-4,IL-13,和IL-10刺激产生。大多数TAMs具有M2型表型,有促进新陈代谢、血管生成和免疫抑制作用。证据表明基质细胞,如肿瘤周围浸润的淋巴细胞,TAMs和与癌相关的纤维细胞在癌症的微环境中与癌症的发展有关,作为M2-TAMs在促进癌肿的浸润、淋巴转移、新生血管形成和免疫抑制中发挥不可替代的作用。近来研究发现M2-TAMs可表达特殊标志物如:CD163和CD204而发挥作用。并发现TAMs在头颈口腔鳞状细胞癌组织中发挥了作用,可能是通过IL-10和PD-L1调节T淋巴细胞发挥了免疫调节作用。肿瘤炎性微环境中的高密度TAMs表达与直肠癌病人较差的预后密切相关。并且发现外周单核细胞与肿瘤微环境中的TAMs密度有关联性。集落刺激因子-1(Colony Stimulating Factor-1,CSF-1)刺激TAMs趋化作用中有重要作用,导致肿瘤边缘区域TAMs的大量聚集,从而参与了结肠癌细胞的浸润、转移的发生。CSF-1或CSF-1R两者被抑制也可能成为阻断TAMs的有效方法之一,CSF-1在许多癌症和恶性肿瘤细胞中有高表达情况,与许多恶性肿瘤有关联性,并且与患者较差的预后有关。而另一个有效控制TAMs活性的方法在于导致其有效凋亡,某些化学物质如氯膦酸二钠和唑来膦酸可有效抑制巨噬细胞的活性,使其运动能力减弱,活性降低,其中氯膦酸可直接破坏肿瘤相关巨噬细胞使其凋亡,导致数量降低,有效阻断肿瘤细胞的生长、新生血管形成和肿瘤的转移。肿瘤相关巨噬细胞受到某种刺激或激发后导致表型的改变,将肿瘤浸润的骨髓巨噬细胞重新编码成为抗肿瘤表型从而达到抑制肿瘤细胞活性的目的,可能成为一种治疗肿瘤的方法。许多喉癌患者已经诊断为晚期或淋巴结出现转移,在喉癌早期非特征性的表现导致了误诊的发生,对喉癌细胞生物学活性的研究对诊断早期喉癌有重要作用,这对于掌握喉癌发生、发展和浸润、转移的分子机制对提供了可能。从以上受到启发,首先我们研究了 CD68抗体标记的肿瘤相关巨噬细胞CD68-TAMs在喉鳞癌组织的表达及与临床病理参数的关系,并且探讨了 CD68-TAMs表达情况的临床意义。采用Hep-2细胞作为研究对象,利用RNAi技术,通过细胞培养,技术合成和设计等方法,有目的性对TAMs作用,并合成重组质粒shRNA,通过对Hep-2细胞的转染作用,使用PCR和MTT来测定目的基因有无实质性改变,从而得出干扰性TAMs基因经过干扰后的表达情况及对肿瘤细胞活性的影响,得出我们所需要的结论与预期有无差异,也为随后的喉癌分子生物学研究提供一定的理论依据。第一部分CD68-TAMs在喉鳞癌组织表达及临床意义[目的]研究CD68抗体标记的肿瘤相关巨噬细胞CD68-TAMs在喉鳞癌组织的表达及与临床病理参数的关系,探讨CD68-TAMs表达情况临床意义。[方法]收集潍坊医学院附属医院病理科2010年8月—2016年10月所存喉癌标本45例,女12例;男33例,年龄45-78岁,平均64.2岁。在肿瘤旁取组织20例作为对照组,命为瘤旁非肿瘤组织。常规病理检查确定为喉鳞状细胞癌。按照2002年国际抗癌联盟(UICC)制定的TNM分期标准,Ⅰ期(15例),Ⅱ期(17例),Ⅲ期(9例),Ⅳ期(4例)。所有患者术前未行放、化疗治疗。采用免疫组织化学SP法和判定标准,阳性染色以肿瘤细胞胞浆和细胞核周棕黄和黄色为阳性染色,以阳性染色细胞数大于100%以上表示细胞染色为阳性反应。数据分析采用计算机统计软件SPSS13.0、t检验,Spearman等级相关处理和χ 2检验作为一般的统计方法。以p<0.05作为有显著性差异而有统计学意义。[结果]发现CD68在肿瘤组织和瘤旁非肿瘤组织的阳性表达率为83.3%(37/45)、15%(3/20),两者统计学比较差异有显著性(P<0.05)CD68-TAMs在声门区和声门上区部位阳性表达率分别为70.6%(12/17)、89.2%(25/28),两者阳性表达率比较差异性不显著(χ 2=2.54,P>0.05)。有淋巴结转移组与无淋巴结转移组CD-TAMs阳性表达率分别为(100.0%VS57.9%),两者比较差异性显著p<0.05.在病理分级中高、中、低分化CD68阳性表达率比较差异性不显著(P>0.05)。[结论]CD68-TAMs在喉鳞状细胞癌组织有高表达情况,说明CD68-TAMs参与了喉癌生物学行为的过程,与淋巴结转移和肿瘤临床分期的正相关性说明喉鳞状细胞癌中晚期更有利于形成炎性微环境从而产生更多的CD68-TAMs表达,CD68-TAMs在促进喉鳞癌组织的转移及新生血管形成中发挥了作用,可作为判断喉癌侵袭及转移的重要标志物。第二部分RNAi沉默TAM基因表达对喉癌Hep-2细胞侵袭性的影响[目的]采用RNA干扰技术沉默喉癌Hep-2细胞中的肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)的表达,并探讨沉默TAMs基因表达后对喉癌Hep-2细胞侵袭能力的影响,为喉癌的TAMs基因治疗提供一个新的、有效的理论依据。[方法]巨噬细胞提取和培养;真核表达载体的shRNA的构建;针对shRNA靶点设计oligos,根据TAM基因序列参考Genbank数据库有效合成oligos。对oligos进行稀释、退火;对表达的载体进行连接。热激转化E.coli感受态细胞;鉴定阳性克隆。质粒抽提和测序;喉癌Hep-2细胞的培养、计数、传代、冻存。细胞转染及转染条件的优化、在倒置显微镜下观察转染率,按照SiRNA实验组要求将TAMs基因分为,空白对照组,阴性对照组,荧光PCR定量检测。按照基因数据库所具有的TAM基因序列,在保守区利用分子基因软件将Primer5 PCR扩增和引物设计,以内参β-actin将引物合成并设计。逆转录和总RNA的提取;细胞体外增殖实验(MTT)检测细胞成活的数量和生长情况。全部统计数据和资料采用SPSS13.0统计软件进行数据统计和处理,采用均数±标准差(χ±S)统计计量数据和资料,资料之间的两组比较采用t检验和χ2检验,采用方差分析比较多组间差异性。[结果]Hep-2喉癌细胞在培养瓶细胞悬液中呈贴壁生长,单层、折光较好,细胞生长迅速,随着时间推移,细胞迅速生长呈现密集排布,细胞胞浆内细颗粒状物质出现,导致细胞折光性减弱,导致部分细胞消失;真核细胞质粒经过酶切后测定其序列发现三组序列完全正确。观察镜下转染结果发现细胞在转染24小时后出现较强的表达荧光状态,并发现约为45%的NC(阴性对照组)转染率,AC(空白对照组)转染率约为35%,大约42%的shRNA-1转染率,约47%的shRNA-2转染率,约为55的shRNA-3转染率。在实验干扰组TAM转染率表达结果较NC、AC有明显的降低。NC、AC两组有比较接近的Hep-2细胞生长描绘曲线,而经过转染后导致TAM能力沉默的siRNAHep-2细胞生长曲线(实验干扰组)与NC、AC比较相对减弱,两者统计学比较差异有显著性(P<0.05)。[结论]RNAi干扰技术转染Hep-2细胞后,能有效的沉默体外培养的Hep-2细胞中TAMs基因的表达;应用特异性shRNA成功下调Hep-2细胞中TAMs基因表达后,经MTT检测结果显示Hep-2细胞的体外增值能力明显减弱,说明喉癌细胞中TAMs基因的高表达可能与喉癌的发生、复发、转移密切相关;TAMs表达的表达的异常可能与Hep-2细胞的生物学行为密切相关,可能是喉鳞状细胞癌侵袭转移机制中的重要肿瘤标志物。