前列消癥汤治疗前列腺癌的网络靶标预测及细胞实验研究

来源 :兰州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xiaoniaohk
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背景前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是一种严重危害男性生命安全的恶性肿瘤,我国PCa的发病率和死亡率均位居世界前列。中医学理论认为PCa发病以虚实夹杂居多,治疗以补虚为主,兼以清解热毒、活血祛瘀、通淋利湿或化痰散结。前列消癥汤由黄芪、生薏苡仁和白花蛇舌草等7味中药组成,是治疗PCa的经验方。本研究对目前临床试验的用药规律分析后发现,上述7味中药是目前临床试验中治疗PCa常用中药。目的(1)探索前列消癥汤治疗PCa的有效成分、靶点和生物学过程,以及参与肿瘤免疫微环境重构的过程。(2)利用分子细胞实验研究前列消癥汤对PC-3细胞增殖、凋亡及转录组学(m RNA表达)和蛋白组学的影响。(3)阐释前列消癥汤治疗PCa的具体作用机制,并筛选出关键靶点及作用通路。方法(1)中药网络药理学和生物信息学:从中药系统药理学数据库与分析平台、传统中药综合数据库等专业数据库和最新研究中收集前列消癥汤有效成分及靶点。从GEO数据库中筛选出GSE69223基因芯片,计算PCa与癌旁正常组织差异表达基因。获取前列消癥汤有效成分-PCa靶点,分析靶点GO富集和KEGG信号通路富集,以预测靶点参与的生物学过程。基于CIBERSORTx,利用R软件生成各样本中免疫细胞浸润度柱状图,并构建前列消癥汤有效成分-PCa靶基因表达和免疫细胞浸润度的相关性热图,分析靶基因表达与免疫浸润的关联。收集TCGA数据库中PCa和癌旁正常组织基因组数据,对差异表达基因进行验证,并验证靶基因与免疫细胞浸润度的相关性。(2)免疫组化检测:从医院收集接受前列腺病理组织活检并确诊为PCa患者的PCa以及癌旁正常组织标本。利用免疫组织化学检测技术测量病理标本中关键靶基因对应蛋白的表达,再次验证数据库预测结果。(3)分子细胞实验:配制前列消癥汤培养液,观察不同药物浓度培养液及作用时间对PC-3细胞增殖的影响。根据OD(Optical Density)值获取最佳药物浓度和培养时间,依此观察前列消癥汤对PC-3细胞凋亡的影响。利用RT-PCR和WB试验观察前列消癥汤对PC-3细胞中关键靶基因的转录组学(m RNA)及蛋白组学的影响。结果(1)共收集到68个前列消癥汤有效化学成分,对应213个作用靶点。GSE69223基因芯片中PCa与癌旁正常组织基因间有1042个差异表达基因,其中645个基因表达上调,397个基因表达下调。对213个汤药作用靶点与1042个PCa差异表达基因取交集,筛选出19交叉基因。19个基因富集于343个GO条目上,其中包括277个BP条目,39个MF条目,27个CC条目。BP富集条目主要有血液循环调节、血管收缩调节和细胞增值调节等。MF富集条目主要有类固醇激素受体激活、核受体转录辅助因子激活和腺苷三磷酸酶激活等。CC富集条目主要有细胞外区域、质膜区域和等离子体膜等。19个基因富集于43条KEGG信号通路中,主要有甾类激素的合成、糖酵解/糖质新生和EGFR酪氨酸酶抑制剂抗性通路等。(2)CD8 T细胞、静息期CD4记忆性T细胞、活化期CD4记忆性T细胞和M0巨噬细胞在PCa和癌旁正常组织间浸润分数存在差异。靶基因ODC1、CLDN4、ADH1C、CAV1、PTGS1、ADRA1A、PRKCB、PGR、HK2、EGF、FABP5和DPP4的表达被证实与肿瘤免疫微环境重构有关。(3)收集到32例符合要求PCa与癌旁正常组织标本。免疫组化检测发现SULT1E1对应蛋白在癌组织中表达低于癌旁正常组织,CHRM3和HK2对应蛋白在癌组织中表达高于癌旁正常组织。(4)前列消癥汤对PC-3细胞增殖有明显的抑制作用,抑制率与药物浓度呈正比,与培养时间呈反比。空白组PC-3细胞凋亡率(Mean±SD)为0.41±0.04,药物浓度25 mg/L组PC-3细胞凋亡率(Mean±SD)为2.58±0.26。干预组PC-3细胞中SULTIE1的m RNA表达上调,CHRM3和HK2的m RNA表达下调。干预组PC-3细胞中SULT1E1对应蛋白表达高于空白组,HK2和CHRM3对应蛋白表达低于空白组。结论(1)前列消癥汤通过多个中药有效成分、作用靶点和生物学过程发挥治疗PCa的作用。每味中药因有效成分和作用靶点的不同,发挥治疗作用机制各异。前列消癥汤还通过调节T细胞和巨噬细胞的浸润参与到PCa免疫微环境的重构中,发挥治疗作用。(2)独立数据集验证和免疫组织化学检测结果表明,本次中药网络药理学和生物信息学分析结果可靠。(3)前列消癥汤对PC-3细胞增殖与凋亡具有调节作用,与培养时长、药物浓度有关,为体内试验提供了基础。前列消癥汤能调节PC-3细胞中基因SULT1E1、CHRM3和HK2对应m RNA及蛋白的表达,表明上述靶点及参与通路在干预过程中具有重要作用。
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