论文部分内容阅读
血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)是近年来成为引起我国雏鸭肝炎的主要病原之一,因此,研发安全有效的血清3型鸭甲型肝炎疫苗是当务之急。目前,本实验室已经成功将一株DHAV-3 HuB分离株通过SPF鸡胚连续传代培养60代次,获得了DHAV-3减毒株HuB60。本研究通过将HuB60株连续回归SPF雏鸭进行毒力返强试验,从临床和剖检观察、病理组织学和肝功能指标检查及病毒全基因测序分析等方面进行研究,以了解HuB60株的安全性和遗传稳定性,为筛选理想的疫苗候选毒株提供理论依据。主要研究内容包括:1.HuB60毒株毒力返强试验的临床及剖检观察临床观察毒力返强试验的各传代试验鸭,各代次回归试验鸭的精神、饮水、采食、生长情况均正常;随机扑杀的试验鸭进行解剖观察,肝、脾、肾、胰、肺、脑、肠道等组织器官无肉眼可见病理变化。强毒对照鸭,于感染DHAV-3 SD强毒后24h左右开始出现了神经症状,运动失调、头往后背,两腿后蹬,呈现明显的角弓反张的姿势,并很快死亡;剖检观察见肝脏肿大、呈点状或斑块状出血、质脆,脾脏、肾脏肿大等变化,表明HuB60毒株安全、毒力稳定。2.HuB60毒力返强试验雏鸭肝组织病毒检测通过对毒力返强试验各回归代次鸭肝组织RT-PCR检测均能检测到DHAV-3阳性,采用接种鸡胚的方法能成功地从各回归代次试验鸭肝组织分离到DHAV-3,并且从肝组织毒价测定结果可知第1、2代回归试验鸭的肝组织含毒量相对较低,为10-4.70-10-4.92ELD50/ml,回归第3代以后鸭的肝组织毒含量稳定在-7.02-10-8.08ELD50/ml范围内,表明HuB60毒株能在鸭体稳定增殖。3.HuB60毒株对雏鸭肝功能影响的研究通过对毒力返强试验的各代次回归试验鸭接种病毒后48h采血、分离血清,进行谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰胺转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)四种血清酶和胆红素指标的测定,检测结果显示:试验鸭的四种反映肝功能指标血清酶和总胆红素(TBIL)测定值与健康对照鸭均无明显差异,但强毒对照鸭的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)显著升高。试验结果表明HuB60株对雏鸭肝脏细胞无损伤。4.HuB60毒株对雏鸭组织器官的损伤研究通过对毒力返强试验的第5、第8代试验鸭主要内脏组织进行组织病理切片检查,均未发现组织结构有异常变化。试验雏鸭肝脏组织肝锁、肝小叶结构清晰;肺泡内无异物;肾小球结构清晰、无肿胀等异常。SD强毒对照鸭肝脏出血、肝细胞肿胀坏死,并伴有淋巴细胞浸润;脾脏的脾小结内淋巴细胞稀疏,生发中心不明显或消失,出现大量凋亡细胞;肾脏肾小球肿胀、肾小囊腔消失;心脏肌纤维断裂、心肌出血等。从组织病理学方面证明HuB60株毒力不易返强。5.HuB60毒株在遗传稳定性的研究HuB60毒株不包括Poly(A)尾的核苷酸序列全长为7773个核苷酸残基,包括长度为651nt的5’UTR、366nt的3’UTR和由6756个核苷酸组成的ORF,其中ORF可编码2252个氨基酸的多聚蛋白。通过对HuB60-F5与HuB60全序列比对和分析结果表明,全基因组核苷酸序列没有发生插入或缺失,两者仅有6个核苷酸差异,但ORF氨基酸序列未发生改变,说明6个位点发生的核酸序列突变仅为沉默突变,对病毒的毒力和致病性不会产生影响。但是HuB60-F8与HuB60相比,F8的ORF中2个碱基的突变引起了氨基酸发生变化,这两个氨基酸位点均位于2C蛋白,即1242位点的脯氨酸(P)突变为亮氨酸(L)和1418位点的谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R),两个位点氨基酸改变是否会导致HuB60毒力返强有待进一步研究证实。综上所述,HuB60弱毒株经过连续在鸭体内回归8代次的毒力返强试验,从临床和剖检观察、肝功能指标血清酶的测定、病理组织学检查及分子生物学等方面研究表明该毒株具有遗传性稳定、毒力返强风险较小的特点。