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【研究背景】
人乳头瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）是一种双链DNA病毒，主要感染粘膜和上皮组织。低危型的HPV6和11等主要导致尖锐湿疣的发病。高危型HPV如HPV16、18、30和31等则具有致癌性，其持续感染与癌前病变如宫颈上皮内瘤变和鲍温样丘疹病、宫颈癌以及皮肤鳞状细胞癌等有关。E6、E7是HPV的主要致癌基因，可分别通过降低抑癌蛋白p53和抑癌蛋白Rb的表达及活性，使细胞增殖活跃和凋亡减少，并增加端粒酶活性及介导细胞周期活跃来导致细胞的永生化。HPV致癌有氧化应激作用的协同参与，氧化应激主要通过增加基因组的不稳定性和病毒DNA的整合率、促进细胞增殖以及抑制细胞凋亡等来参与HPV的致癌作用，这个过程中也有E6蛋白及E7蛋白的协同作用。Nrf2通路是细胞内重要的抗氧化通路，既往研究发现宫颈癌细胞中出现总Nrf2表达增加及Nrf2信号通路活跃的现象，提示HPV致癌与氧化应激作用的协同作用可能与Nrf2信号通路有关。
茶多酚(TeaPolyphenols,TP)是绿茶中的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤等作用，其主要成分有没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子儿茶素（EGC）、儿茶素（ECG）和表儿茶素（EC）等，2015美国疾病控制中心指南提出使用15%TP软膏治疗尖锐湿疣。多个临床试验显示，外用TP可显著提高生殖器疣的治愈率及降低其复发率。TP可通过抑制HPV的E6、E7致癌蛋白、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制端粒酶活性、调节细胞周期及抑制血管生成等机制，保护HPV阳性细胞免受癌变。既往多个研究证实TP通过各种机制激活Nrf2信号通路，有抗HPV以及防御HPV相关癌变的作用。但有关TP对癌前病变细胞生长的影响目前研究较少。
HPV16亚型永生化人宫颈上皮细胞（H8细胞）是中国妇女正常宫颈鳞柱状上皮交界处的鳞状上皮细胞在体外转染了HPV16的E6和E7基因后转变成的永生化细胞株，在一些促癌因子作用下即可转化为癌细胞，可视为一种癌前状态的细胞，是观察HPV感染与致癌的理想模型。本研究拟用茶多酚处理H8细胞，进而观察细胞增殖、细胞分化与细胞凋亡和HPV16E6、HPV16E7、P53、Rb蛋白以及凋亡相关蛋白和Nrf2信号通路的激活情况，探讨茶多酚对H8细胞的细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期的影响及其可能的潜在机制。
【目的】
1.探讨TP对H8细胞的细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期与端粒酶活性的影响。
2.探讨TP对H8细胞HPV16E6、HPV16E7、P53、Rb蛋白和Caspase3、Caspase9、Bax、Bcl-2蛋白以及H8细胞内Nrf2蛋白分布情况及Nrf2下游的HO-1蛋白表达的影响，进一步探讨TP影响H8细胞生长的机制。
【方法】
1.不同浓度茶多酚作用于H8细胞24h后，CCK-8法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期分布，DAPI染色观察细胞凋亡形态，PCR-ELISA法检测端粒酶活性。
2.不同浓度茶多酚作用于H8细胞24h后，WesternBlot法检测HPV16E6、HPV16E7、P53、Rb蛋白和Caspase3、Caspase9、Bax、Bcl-2蛋白以及细胞内Nrf2蛋白分布及Nrf2下游HO-1蛋白的表达。
【结果】
1.不同浓度（12.5μg/m1、25μg/m1、50μg/m1）茶多酚孵育H8细胞24h后，CCK-8法检测显示，与对照组（0μg/m1）相比，细胞相对生长率均降低（均P＜0.05）；与对照组（0μg/m1）相比，各浓度组茶多酚作用H8细胞24h时后细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（均P＜0.05）；各浓度茶多酚作用H8细胞24h后，对照组（0μg/m1）细胞核型较完整，染色质较均匀，其他浓度茶多酚处理H8细胞24h后可见细胞核染色质聚集、核固缩、核碎裂和凋亡小体等细胞凋亡形态学变化；与对照组（0μg/ml）相比，12.5、25μg/ml的茶多酚作用H8细胞24h后，G1期细胞构成比增加，G2期细胞构成比降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组（0μg/m1）相比，各浓度茶多酚作用H8细胞24h后细胞RTA值降低，差异有统计学意义（均P＜0.05）。
2.各浓度（12.5μg/m1、25μg/m1）茶多酚作用H8细胞24h后，与对照组（0μg/m1）相比，WesternBlot结果显示HPV16E6、HPV16E7蛋白表达量明显减少，P53、Rb、Caspase3、Caspase9蛋白表达明显增加，Bax/Bcl-2蛋白比值明显增加，Nrf2在胞质内表达明显减少同时在核内表达明显增加，Nrf2下游的HO-1蛋白表达明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。
【结论】
茶多酚可通过减少细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、降低端粒酶活性来抑制H8细胞的生长，其机制可能与降低致癌蛋白HPV16E6和HPV16E7的表达、诱导抑癌蛋白P53、Rb和凋亡相关蛋白Caspase3、Caspase9的表达、上调促凋亡蛋白Bax和凋亡抑制蛋白Bcl-2的比值以及激活Nrf2信号通路有关。
人乳头瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）是一种双链DNA病毒，主要感染粘膜和上皮组织。低危型的HPV6和11等主要导致尖锐湿疣的发病。高危型HPV如HPV16、18、30和31等则具有致癌性，其持续感染与癌前病变如宫颈上皮内瘤变和鲍温样丘疹病、宫颈癌以及皮肤鳞状细胞癌等有关。E6、E7是HPV的主要致癌基因，可分别通过降低抑癌蛋白p53和抑癌蛋白Rb的表达及活性，使细胞增殖活跃和凋亡减少，并增加端粒酶活性及介导细胞周期活跃来导致细胞的永生化。HPV致癌有氧化应激作用的协同参与，氧化应激主要通过增加基因组的不稳定性和病毒DNA的整合率、促进细胞增殖以及抑制细胞凋亡等来参与HPV的致癌作用，这个过程中也有E6蛋白及E7蛋白的协同作用。Nrf2通路是细胞内重要的抗氧化通路，既往研究发现宫颈癌细胞中出现总Nrf2表达增加及Nrf2信号通路活跃的现象，提示HPV致癌与氧化应激作用的协同作用可能与Nrf2信号通路有关。
茶多酚(TeaPolyphenols,TP)是绿茶中的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤等作用，其主要成分有没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子儿茶素（EGC）、儿茶素（ECG）和表儿茶素（EC）等，2015美国疾病控制中心指南提出使用15%TP软膏治疗尖锐湿疣。多个临床试验显示，外用TP可显著提高生殖器疣的治愈率及降低其复发率。TP可通过抑制HPV的E6、E7致癌蛋白、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制端粒酶活性、调节细胞周期及抑制血管生成等机制，保护HPV阳性细胞免受癌变。既往多个研究证实TP通过各种机制激活Nrf2信号通路，有抗HPV以及防御HPV相关癌变的作用。但有关TP对癌前病变细胞生长的影响目前研究较少。
HPV16亚型永生化人宫颈上皮细胞（H8细胞）是中国妇女正常宫颈鳞柱状上皮交界处的鳞状上皮细胞在体外转染了HPV16的E6和E7基因后转变成的永生化细胞株，在一些促癌因子作用下即可转化为癌细胞，可视为一种癌前状态的细胞，是观察HPV感染与致癌的理想模型。本研究拟用茶多酚处理H8细胞，进而观察细胞增殖、细胞分化与细胞凋亡和HPV16E6、HPV16E7、P53、Rb蛋白以及凋亡相关蛋白和Nrf2信号通路的激活情况，探讨茶多酚对H8细胞的细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期的影响及其可能的潜在机制。
【目的】
1.探讨TP对H8细胞的细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期与端粒酶活性的影响。
2.探讨TP对H8细胞HPV16E6、HPV16E7、P53、Rb蛋白和Caspase3、Caspase9、Bax、Bcl-2蛋白以及H8细胞内Nrf2蛋白分布情况及Nrf2下游的HO-1蛋白表达的影响，进一步探讨TP影响H8细胞生长的机制。
【方法】
1.不同浓度茶多酚作用于H8细胞24h后，CCK-8法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期分布，DAPI染色观察细胞凋亡形态，PCR-ELISA法检测端粒酶活性。
2.不同浓度茶多酚作用于H8细胞24h后，WesternBlot法检测HPV16E6、HPV16E7、P53、Rb蛋白和Caspase3、Caspase9、Bax、Bcl-2蛋白以及细胞内Nrf2蛋白分布及Nrf2下游HO-1蛋白的表达。
【结果】
1.不同浓度（12.5μg/m1、25μg/m1、50μg/m1）茶多酚孵育H8细胞24h后，CCK-8法检测显示，与对照组（0μg/m1）相比，细胞相对生长率均降低（均P＜0.05）；与对照组（0μg/m1）相比，各浓度组茶多酚作用H8细胞24h时后细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（均P＜0.05）；各浓度茶多酚作用H8细胞24h后，对照组（0μg/m1）细胞核型较完整，染色质较均匀，其他浓度茶多酚处理H8细胞24h后可见细胞核染色质聚集、核固缩、核碎裂和凋亡小体等细胞凋亡形态学变化；与对照组（0μg/ml）相比，12.5、25μg/ml的茶多酚作用H8细胞24h后，G1期细胞构成比增加，G2期细胞构成比降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组（0μg/m1）相比，各浓度茶多酚作用H8细胞24h后细胞RTA值降低，差异有统计学意义（均P＜0.05）。
2.各浓度（12.5μg/m1、25μg/m1）茶多酚作用H8细胞24h后，与对照组（0μg/m1）相比，WesternBlot结果显示HPV16E6、HPV16E7蛋白表达量明显减少，P53、Rb、Caspase3、Caspase9蛋白表达明显增加，Bax/Bcl-2蛋白比值明显增加，Nrf2在胞质内表达明显减少同时在核内表达明显增加，Nrf2下游的HO-1蛋白表达明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。
【结论】
茶多酚可通过减少细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、降低端粒酶活性来抑制H8细胞的生长，其机制可能与降低致癌蛋白HPV16E6和HPV16E7的表达、诱导抑癌蛋白P53、Rb和凋亡相关蛋白Caspase3、Caspase9的表达、上调促凋亡蛋白Bax和凋亡抑制蛋白Bcl-2的比值以及激活Nrf2信号通路有关。