背景自1832年Thomas Hodgkin首次发现人类淋巴瘤以来,关于人类淋巴瘤的研究一直在稳步发展。其中,弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse Large B-cell Lymphoma,DLBCL）是一种来源于成熟B淋巴细胞的侵袭性恶性肿瘤,约占非霍奇金淋巴瘤病例的40%。作为非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin Lymphomas,NHL）最常见的亚型,其在临床上表现出高度异质性。只有部分患者对当前治疗反应良好并延长了生存期,而剩余患者则对该疾病的疗效反馈不佳。治疗上的这种差异性反映了肿瘤中未被识别的分子的异质性。随着以利妥昔单抗为基础的免疫治疗的出现,DLBCL的临床治疗取得了比较大的突破。然而,30%-40%的患者仍然出现疾病复发,挽救治疗的反应率也相对较低。因此,开发新的更有效的治疗方案成为现在亟需解决的问题。由于其高度选择性的抗肿瘤作用,分子靶向治疗在临床药物研发和肿瘤治疗中的影响正在迅速增长。然而,许多侵袭性肿瘤,如DLBCL和三阴性乳腺癌（Triple-negative Breast cancer,TNBC）目前仍缺乏明确的治疗靶点。近些年来,已经有研究证实,基因的异常表达会导致信号通路的改变和治疗反应的变化。这些基因和信号的变化如何进一步促进淋巴瘤的进展仍不清楚,新的治疗靶点仍需深入探索。糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B（Glycoprotein Non-Metastatic Melanoma Protein B,GPNMB）是一种在包括TNBC在内的多种癌症中过度表达的蛋白,并且通常与转移表型相关。人类GPNMB是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白,作为可变剪接的结果,它以两种多肽同种型的形式出现,包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。GPNMB最初是从转移不良的黑色素瘤细胞中克隆出来的,目前已被证实能够在多种正常组织中表达。它在视网膜和皮肤中的表达相对较高,其次是脂肪组织、骨髓、肺、宫颈和免疫系统,再其次是肝脏和肌肉。据报道,有以下几种细胞类型可以表达GPNMB:包括吞噬细胞（树突状细胞和巨噬细胞）、破骨细胞和黑素细胞等。此外,在黑色素瘤细胞和其他类型的癌细胞中,GPNMB的高表达也得到了很好的证明。值得注意的是,GPNMB与多种生物学过程有关,如增殖、凋亡和转移。在几种恶性肿瘤如葡萄膜黑色素瘤、前列腺癌和肺癌中,GPNMB水平被发现明显升高。而且,恶性肿瘤组织中GPNMB的表达还可以增强肿瘤细胞的侵袭性,GPNMB能够促进肿瘤生长和转移,被认为是一种新的癌症治疗靶点。然而,目前对GPNMB在DLBCL中的影响及相关的机制研究仍然缺乏。此外,Hippo信号通路也在细胞增殖、细胞死亡、干细胞和癌细胞的调节等许多过程中起着关键作用。近来有研究表明,Yes相关蛋白1（YAP1）作为Hippo信号通路的关键效应因子,在调节多种人类恶性肿瘤的细胞生长、凋亡和耐药性方面发挥转录共激活作用。当Hippo信号失活时,YAP1被激活并进入细胞核与转录因子TEAD融合,从而诱导一系列与增殖相关的基因的表达,如c-myc和cyclin D1。在某些情况下,YAP1也可以在抑制肿瘤发展方面发挥作用。例如,在DNA损伤过程中,YAP1能够增强p37的依赖性和ABL1诱导的细胞凋亡。因此,更好地理解Hippo-YAP1信号通路对于癌症的预防和治疗具有非常积极的意义。先前的一项研究表明,YAP在体外和体内都能够促进DLBCL细胞的生长。同时,通过GEPIA数据库观察到在DLBCL中GPNMB和YAP1之间有显著的正相关性。因此,我们猜想GPNMB是否能通过上调YAP1而促进DLBCL的进展,但目前还未见有相关的报道。在这项研究中,我们使用qRT-PCT和蛋白质印迹法分析GPNMB和YAP1在DLBCL细胞系中的表达水平,并探究GPNMB的敲低对YAP1和Hippo通路下游效应子c-myc的表达水平的影响以及β-catenin蛋白的核转位情况。使用CCK-8、EdU和流式细胞术检测DLBCL细胞的增殖和凋亡,探究GPNMB的敲低是否抑制了 DLBCL细胞的增殖以及对细胞凋亡是否产生了影响。建立裸鼠异种移植模型用于体内研究,证实GPNMB的敲低是否在体内抑制了 DLBCL的肿瘤发生。目的1.检测GPNMB和YAP1在DLBCL细胞系中的表达水平2.探究GPNMB对DLBCL细胞的增殖、凋亡以及对YAP1和Hippo通路下游效应子c-myc、β-catenin蛋白的核转位水平的影响3.探究YAP1过表达或LiC1（Wnt/β-catenin通路的激活剂）的引入是否会影响由于GPNMB敲低所带来的有关增殖和促凋亡现象4.探究GPNMB的敲低是否在小鼠体内抑制了 DLBCL的肿瘤发生材料与方法1.DLBCL细胞系:DS（ATCC获得）、DB（Procell获得）、CYP6（中国科学院获得）和正常人B淋巴细胞HCC38BL（ATCC获得）在含10%胎牛血清（FBS;Gibco）和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中培养。培养箱温度为37℃,培养箱中CO2含量为5%。使用qRT-PCR和蛋白质印迹法分析GPNMB和YAP1的表达水平。2.使用细胞计数试剂盒-8、EdU和流式细胞术检测DLBCL细胞的增殖和凋亡。3.12只雌性BALB/c裸鼠（4-6周龄）获自北京华富康生物科技有限公司（中国北京）,将其随机分为两组。建立裸鼠异种移植模型用于体内研究。结果1.通过使用 Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA）在线数据库,我们发现GPNMB在DLBCL中的表达明显上调。同时,我们还使用qRT-PCR和蛋白质印迹法检测GPNMB在DLBCL细胞系中的表达。结果表明,DS、DB和CYP6细胞中GPNMB的表达明显高于HCC38BL细胞。此外,蛋白质印迹分析表明,与HCC38BL细胞相比,DLBCL细胞中GPNMB的蛋白质表达也出现了上调。这些结果表明GPNMB的异常表达可能与DLBCL的肿瘤发生有关。2.为了研究GPNMB在DLBCL肿瘤发生中的作用,使用GPNMB shRNA（sh-GPNMB#1 或 sh-GPNMB#2）敲低 DLBCL 细胞系（DS 和 CYP6）中的GPNMB。研究结果表明,在转染后,DS和CYP6细胞中GPNMB的mRNA和蛋白质水平显著降低。GPNMB敲低可以显著降低DLBCL细胞的活力,而且,在GPNMB敲低的DLBCL细胞中,EdU阳性细胞的数量减少。这些结果表明GPNMB的敲低可以抑制DLBCL细胞的体外增殖。在这里,我们选择sh-GPNMB#1进行后续实验并命名其为sh-GPNMB。3.接着,我们进一步研究了 GPNMB对DLBCL细胞凋亡的影响。当GPNMB被敲低时,流式细胞术分析结果表明DLBCL细胞中凋亡细胞的百分比明显更高。同样地,GPNMB的敲低抑制了 PCNA和Bcl-2的表达,同时增强了 DLBCL细胞中裂解的caspase-3的表达。这些结果表明,GPNMB的敲低诱导了 DLBCL细胞凋亡。4.在线GEPIA数据库显示,YAP1在DLBCL中的表达上调,并且在DLBCL中观察到GPNMB和YAP1之间的正相关关联。因此,我们随后评估了 GPNMB是否参与了 DLBCL细胞中YAP1的调节。qRT-PCR和蛋白质印迹分析也证实了YAP1的表达在DLBCL细胞中显著上调。此外,敲低GPNMB可以抑制DLBCL细胞中YAP1 mRNA和蛋白质的表达。同时,Hippo-YAP通路下游基因c-myc的表达水平也随着GPNMB的下调而降低。5.以往的研究表明,YAP可以促进β-catenin的核易位和转录活性。同时,cyclin D1和c-myc也是Wnt/β-catenin通路中的关键基因。我们进一步评估了GPNMB对YAP1的调节是否涉及Wnt/β-catedddddnin通路。GEPIA在线数据库显示DLBCL中β-catenin的表达水平升高,且β-catenin与YAP1和GPNMB均呈正相关。6.为了研究YAP1是否可以影响DLBCL中的Wnt/β-catenin信号通路,我们将YAP1 siRNA转染到DLBCL细胞中。结果表明,YAP1的敲低抑制了细胞核β-catenin的表达,同时增强了细胞质β-catenin的表达。这些结果表明YAP1调节了 Wnt/β-catenin通路的活性。此外,β-catenin蛋白的细胞核易位也受到GPNMB敲低的抑制,这可以通过引入YAP1-OE来恢复。7.CCK-8检测结果表明GPNMB的敲低抑制了 DLBCL细胞的活力,这可以通过引入YAP1过表达载体或LiCl来阻止。类似地,当YAP1过表达或Wnt/β-catenin通路被激活时,由GPNMB敲低引起的DLBCL细胞增殖能力降低现象可以得到部分缓解。此外,通过YAP1过表达或LiCl处理可以恢复由GPNMB敲低导致的细胞凋亡。同样地,由GPNMB敲低引起的PCNA和Bcl-2减少以及裂解的caspase-3水平增加可以通过YAP1过表达或LiCl处理来消除。总的来说,这些数据表明GPNMB通过YAP1介导的Wnt/β-catenin通路促进了 DLBCL细胞的肿瘤发生。8.用CYP6细胞（稳定转染sh-NC或sh-GPNMB）建立DLBCL异种移植小鼠模型,以此来探讨GPNMB敲低对体内DLBCL细胞生长的影响。与sh-NC组相比,sh-GPNMB组的肿瘤大小和肿瘤重量得以有效减少。此外,与sh-NC组相比,sh-GPNMB组小鼠肿瘤组织中GPNMB mRNA和蛋白质的表达显著降低。与此同时,sh-GPNMB组小鼠肿瘤组织中Bcl-2的表达也降低。我们接着使用HE染色观察异种移植肿瘤的形态。HE染色结果表明,与sh-NC组相比,sh-GPNMB组肿瘤细胞排列较松散,可见细胞核发生了固缩和碎裂。接着,IHC结果显示,在sh-GPNMB组的组织中观察到PCNA和Bcl-2的显著减少以及裂解的caspase-3增加,表明GPNMB敲低对DLBCL具有抗肿瘤作用。这些研究结果表明,GPNMB通过YAP1介导的Wnt/β-catenin信号通路的激活促进了DLBCL的进展。结论1.GPNMB 参与了 Hippo 和 Wnt/β-catenin 信号的调节2.GPNMB通过靶向YAP1激活Wnt/β-catenin信号通路在DLBCL中发挥重要的调控作用