【摘 要】
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C型凝集素（C-type lectin,CTL）是一类Ca2+依赖的碳水化合物识别蛋白的超家族,广泛参与非自我识别并激活固有免疫中的信号转导途径。海洋无脊椎动物中C型凝集素结构和功能多样,在识别病原、激活免疫信号途径、调控效应分子合成中发挥重要的作用。本论文以长牡蛎（Crassostrea gigas）为研究对象,利用生物信息学、分子生物学和免疫学等技术对含单个碳水化合物识别结构域（Carbohy
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C型凝集素（C-type lectin,CTL）是一类Ca2+依赖的碳水化合物识别蛋白的超家族,广泛参与非自我识别并激活固有免疫中的信号转导途径。海洋无脊椎动物中C型凝集素结构和功能多样,在识别病原、激活免疫信号途径、调控效应分子合成中发挥重要的作用。本论文以长牡蛎（Crassostrea gigas）为研究对象,利用生物信息学、分子生物学和免疫学等技术对含单个碳水化合物识别结构域（Carbohydrate-recognition domain,CRD）和跨膜结构域的C型凝集素Cg CLec-TM2的分子特征和免疫学功能开展研究,取得的研究结果如下:从长牡蛎中鉴定出一种新型C型凝集素（命名为Cg CLec-TM2）。Cg CLec-TM2基因的开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）为789 bp,编码一条由262个氨基酸组成的多肽,其理论分子量为29.91 k Da,等电点为5.16。Cg CLec-TM2含有一个长度为366 bp的CRD结构域,也称为C型凝集素结构域（C-type lectin domain,CLECT）。CRD结构域中含有七个保守的半胱氨酸残基位点,在CRD中的Ca2+结合位点2上鉴定出两个与其他C型凝集素不同的新基序EFG（Glu-Phe-Gly）和FVN（Phe-Val-Asn）。Cg CLec-TM2的m RNA在血淋巴细胞、鳃、唇瓣、外套膜、闭壳肌和肝胰腺中均有表达,其中在血淋巴细胞中m RNA表达水平最高,是闭壳肌中表达量的94.41倍（p＜0.01）。灿烂弧菌刺激6,24和48 h后,血淋巴细胞中Cg CLec-TM2的m RNA相对表达水平显著升高,分别为对照组表达量的4.94倍（p＜0.01）,12.77倍（p＜0.01）,3.81倍（p＜0.05）。体外原核表达获得了重组的CRD结构域蛋白（r CRD）,其能够以Ca2+依赖的方式结合脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）、甘露糖（Mannose,MAN）、肽聚糖（Peptidoglycan,PGN）和poly（I:C）,且与PGN和poly（I:C）结合活性较强。r CRD还具有Ca2+依赖的结合革兰氏阴性菌（灿烂弧菌、鳗弧菌、大肠杆菌）、革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌）和真菌（毕赤酵母）的活性,以及Ca2+依赖的凝集革兰氏阴性菌（大肠杆菌、灿烂弧菌）、革兰氏阳性菌（藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌）,真菌（毕赤酵母）的活性。此外,r CRD能够抑制革兰氏阴性菌（灿烂弧菌、大肠杆菌）的生长。利用anti-Cg CLec-TM2-CRD抗体封闭后,血淋巴细胞对灿烂弧菌的吞噬率从27.2%显著降低至20.9%。利用RNAi技术抑制Cg CLec-TM2的表达后,与EGFP-RNAi组牡蛎中的表达水平相比,血淋巴细胞中磷酸化的胞外调节蛋白激酶（p-Cg ERK）的表达水平和白介素17（Interleukin-17,Cg IL17-1/-4）的m RNA表达水平在灿烂弧菌刺激后显著降低,Cg IL17-1和Cg IL17-4的m RNA表达量分别为EGFP对照组的0.39倍（p＜0.01）和0.47倍（p＜0.01）。以上结果表明,Cg CLec-TM2是一个含有新型Ca2+结合基序的C型凝集素,不仅作为模式识别受体参与微生物的识别,还能通过调控p-Cg ERK的表达诱导细胞白介素17的表达进而参与长牡蛎免疫防御。研究结果有助于丰富对长牡蛎C型凝集素免疫学功能的认知,对进一步研究海洋无脊椎动物免疫防御机制具·有重要意义。
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