第一部分鼠疫亚单位疫苗制备以及其在猕猴中的免疫保护评价　　 目的：鼠疫是一种由鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis，以下简称鼠疫菌)引起的人畜共患烈性传染病，通常有腺型、肺型和败血症型三种，其传染性强、死亡率高、人类普遍易感，未经治疗的腺鼠疫病死率达50％至70％，而肺鼠疫发病迅猛，并可以直接在人群中传播，如果治疗不及时，病死率可以达到100％。疫苗是阻断疾病传播的最有效方式，研制出一种安全有效的疫苗是鼠疫防治工作的重点与方向，可以更好的保障人民的生命安全。本实验力图在实验室已有工作的基础上，优化F和V两种蛋白的纯化方法，并找到猕猴在鼠疫亚单位疫苗免疫保护过程中的规律，探讨猕猴作为鼠疫疫苗动物模型的可行性。　　 内容：简化实验方案，从鼠疫菌疫苗株EV76中纯化出天然的F1抗原，并通过克隆表达并用肠激酶切除标签获得了不带标签与天然序列完全相同的V抗原，利用此两种抗原制备亚单位疫苗，并用实验室在小动物实验中已筛选出的免疫方案对猕猴进行了免疫。猕猴共分SV1，SV2，EV76，佐剂空白对照四个组。在初次免疫的第21天加强免疫，并在第10周用鼠疫强毒株进行攻毒，密切观察两周后，解剖动物，观察其体内鼠疫菌存活情况。在免疫的第2，4，6，8，10，11，12周取猕猴血清，测量其血清中的抗体产生情况及血清中细胞因子的分泌情况。　　 方法：采用玻璃珠处理、饱和硫酸铵沉淀和分子筛过滤相结合的方案，从鼠疫菌减毒活疫苗株EV76的培养上清中提取天然的F1抗原。根据已知的lcrV核苷酸序列，避开LcrV抗原产生免疫抑制作用的区段设计引物，克隆表达rV270抗原。表达产物先后经过Co2+亲和层析和Sephacryl S-200 HR凝胶柱纯化，并在纯化过程中应用肠激酶切除His标签。纯化的蛋白用免疫印迹法、N-末端测序、质谱肽图鉴定其性质和纯度。使用氢氧化铝佐剂分别吸附两种抗原后免疫猕猴，使用ELISA方法，测血清中抗体的产生情况和细胞因子的分泌情况。　　 结果：通过SDS-PAGE电泳及WB实验验证，简化方案纯化出的F1蛋白纯度高且具有很好的免疫原性，经肠激酶酶切除掉His标签获得的rV270抗原，通过N-末端测序、质谱测序等方法鉴定其序列正确。利用这两种抗原制备了亚单位疫苗，免疫猕猴发现配制的亚单位疫苗可使动物产生较高的抗体滴度和并具有良好的免疫保护作用。　　 结论：本实验获得了一种简化的从鼠疫中大量纯化天然F1抗原的方法；并通过肠激酶酶切的方法获得了完全不带标签并且无免疫抑制活性的rV270抗原；通过观察猕猴对鼠疫菌感染的敏感性和攻毒后的发病情况，在评价猕猴作为鼠疫动物模型可行性的同时，也得到了亚单位疫苗在类人灵长类中免疫保护的珍贵资料。　　 第二部分以减毒伤寒沙门氏菌为载体的鼠疫疫苗构建及初步评价　　 目的：减毒沙门菌活疫苗是将抗原基因通过减毒的沙门菌这种载体进入体内诱导免疫应答。它的特点是组合了减毒活疫苗强有力的免疫原性和亚单位疫苗的准确度这两个优势。这种活载体疫苗的一个显著特点就是可以在体内有效的诱导细胞免疫。对鼠疫而言，鼠疫菌的在体内的最终清除依赖于机体的细胞免疫，因此这种活载体疫苗在鼠疫疫苗中有着非常光明的前景。本实验目的是构建一株能在体内稳定存在的产生良好免疫保护作用的安全性高的以鼠伤寒沙门菌减毒株为载体的鼠疫活疫苗。　　 内容：本实验以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体构建鼠疫活疫苗，并鉴定了其抗原的表达和分泌情况，体外传代后检查质粒和片段在载体中的稳定性，疫苗接种小鼠检测了其免疫的安全性，并感染巨噬细胞，通过检测TNF-α的分泌来初步判定构建的减毒活疫苗在体内可能引起天然免疫和适应性免疫的能力。　　 方法：利用克隆技术将V抗原的片段克隆进pYA248质粒，并通过化学转化和电转化的方法分步将质粒导入最终宿主菌。SDS-PAGE凝胶电泳和WB鉴定目的抗原的表达和分泌情况。免疫小鼠观察疫苗的安全性。通过感染RAW264.7细胞观察菌对巨噬细胞的激活作用。　　 结果：以鼠伤寒沙门菌减毒株为载体构建了鼠疫活疫苗，初步的实验证明，结果证明构建的减毒鼠疫疫苗，能够在胞外分泌表达V抗原，并且体外传代实验发现质粒和片段在载体菌中可以存在，109cfu口服免疫小鼠安全性良好，感染RAW264.7后能有效激活巨噬细胞，并刺激其分泌大量的TNF-α，　　 结论：为了解决亚单位疫苗只能产生体液免疫的劣势，我们选用鼠伤寒沙门氏菌作为鼠疫活疫苗的载体，并成功获得了一株能稳定分泌V抗原的疫苗株，免疫小鼠可发现其安全性良好，并且刺激巨噬细胞后能使其大量分泌TNF-α。说明这株菌免疫原性良好，还需要后续实验来观察其在体内产生抗体及免疫保护作用。