芦苇秸秆肥料化过程中微生物群落及其抗生素抗性基因动态规律研究

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芦苇(Phragmites australis(Cav.)Trin.ex Steud.)全球广布,生物量大,但由于其木质纤维素含量高,生物质资源利用受到较大限制。目前,以芦苇秸秆与畜禽粪便好氧堆肥为代表的芦苇肥料化成为芦苇资源利用的重要途径。芦苇与粪便好氧堆肥主要受含氮底物类型(即畜禽粪便种类)、底物碳氮比(如秸秆与粪便的配比)及附加投入品(如生物炭)的影响,但这些因素在堆肥发酵过程中对微生物群落的结构和功能,以及粪便中携带的抗生素抗性基因(Antiobictic resistance genes,ARGs)的影响机制尚不清楚。因此,揭示好氧堆肥微生物调控机制、提升芦苇肥料化效率与质量成为需要解答的重要科学问题。为深入了解芦苇秸秆好氧堆肥过程中微生物群落结构的变化和ARGs去除机制,论文基于芦苇秸秆与畜禽粪便好氧堆肥实验,综合采用活性酶谱检测技术、扩增子高通量测序技术以及定量PCR技术相结合的方法,评估了不同富氮底物添加对芦苇秸秆好氧堆肥木质纤维素降解酶的酶活性、酶谱、细菌群落和真菌群落的影响,构建了细菌群落和真菌群落的互作网络,鉴定了影响好氧堆肥微生物网络稳定的关键微生物类群。同时,研究追踪了不同底物碳氮比的芦苇秸秆好氧堆肥过程中ARGs和可移动遗传元件(Mobile genetic elements,MGEs)动态特征,分析了环境因素、微生物群落和MGEs对ARGs的影响。基于生物炭添加对好氧堆肥细菌群落、ARGs和MGEs动态存在较大影响的观点,探讨生物炭添加对芦苇秸秆好氧堆肥过程中细菌群落和ARGs构成的影响,分析了好氧堆肥高温后期和腐熟期ARGs回弹的潜在原因,评估了不同因素对ARGs变化的贡献度,揭示不同处理条件下ARGs去除的机制。得到了以下主要结论:(1)在好氧堆肥过程中,底物中携带的木质纤维素降解酶活性受到高温抑制,而嗜热微生物分泌的高温耐受型木质纤维素降解酶的活性随堆肥进程不断增加。相比于芦苇秸秆牛粪堆垛(RC)和芦苇秸秆蘑菇渣堆垛(RM),芦苇秸秆猪粪堆垛(RP)和芦苇秸秆鸡粪堆垛(RF)好氧堆肥中嗜热木质纤维素降解酶的高效表达要晚,且RC和RM处理的木质纤维素降解酶活在高温前期要高于RF和RP。各处理木质纤维素降解酶在高温期的构成均一、稳定。(2)不同富氮底物添加、底物碳氮比和好氧堆肥进程均能显著改变好氧堆肥过程中细菌群落结构,但生物炭添加并不能显著改变细菌群落结构。在芦苇秸秆好氧堆肥过程中,Bacterodetes和Proteobacteria均是初始底物携带的主要细菌门。Firmicutes利用速效碳源物质迅速大量地繁殖,而微生物代谢产生的高温抑制了初始优势细菌门。随着速效碳源物质消耗导致的木质纤维素相对含量增多,具有强木质纤维素降解能力的Actinobacteria增多。在后续的腐熟阶段,高温胁迫强度降低促进了 Bacterodetes和Proteobacteria的相对含量再次增加。好氧堆肥过程中,真菌门构成相对稳定,Ascomycota始终是好氧堆肥过程中优势的真菌门。在属方面,Thermopolyspora、Planifilum、Bacillus、Thermobifida 和Thermobispora是主要的细菌属,而具有高效木质纤维素降解能力的Thermomyces、Mycothermus和Talaromyces则是主要的真菌属。(3)芦苇秸秆好氧堆肥过程中,细菌和真菌主要通过正向的互作形成复杂跨界互作网络,底物性质和稀有种对微生物互作网络影响较大。微生物界间的竞争(细菌—真菌)要强于界内的竞争(细菌一细菌,真菌—真菌)。好氧堆肥中包含更多速效碳源物质有助于维持微生物跨界互作网络的稳定,RC和RM处理中微生物跨界互作网络复杂度小于RF和RP。此外,维持微生物跨界互作网络的关键微生物类群均为稀有种。(4)不同底物碳氮比和堆肥进程能够显著改变芦苇秸秆好氧堆肥过程中ARGs构成,而生物炭添加对芦苇秸秆堆肥过程中ARGs构成没有显著影响。在芦苇秸秆牛粪好氧堆肥过程中,高温期对ARGs的去除是通过抑制抗生素抗性基因宿主细菌Advenella、Tepidimicrobium、Proteiniphilum、Acinetobacter、Pseudomonas、Flavobacteria和Arcbacter起作用的。在芦苇秸秆鸡粪和芦苇秸秆猪粪的好氧堆肥过程中,ARGs潜在宿主Caldicoprobacter、Tepidimicrobium、Pseudogrncilibacillus、Ignatzschineria 受到高温抑制造成了总 ARGs 相对丰度的减少,ARGs 潜在宿主Actinomadura、Galbibacter、Flavobacterium、Vulgatibacter、Planifilum和Thermobispora等在腐熟期的富集造成了总ARGs相对丰度的回弹。(5)细菌群落是芦苇秸秆与畜禽粪便好氧堆肥过程中ARGs组成的直接影响因素,而真菌群落、MGEs及环境因素的影响相对较小。在芦苇秸秆牛粪好氧堆肥实验中,细菌群落改变是影响好氧堆肥过程中ARGs的主要原因,真菌群落通过影响细菌群落间接改变了 ARGs构成。在芦苇秸秆猪粪好氧堆肥和芦苇秸秆鸡粪好氧堆肥中,影响ARGs结构的关键因素除了细菌群落以外,还有MGEs和环境因素。初始微生物的再次生长和嗜热阶段微生物的保留是ARGs总相对丰度回弹的潜在原因。综上,芦苇秸秆与畜禽粪便好氧堆肥过程中,含氮底物类型、底物碳氮比、碳组分组成等底物养分状况是影响微生物群落组成、木质纤维素降解功能和ARGs组成的主导因素,而外源生物炭的添加对细菌群落和ARGs构成的影响较小;微生物群落及ARGs组成在堆肥发酵过程中存在较大变化,细菌和真菌之间存在着较强的跨界正向互作网络,稀有种在其中起着重要作用;ARGs动态的关键驱动因素为细菌群落变化,并间接受真菌群落及环境因素的影响。该论文探究了芦苇有氧堆肥过程中肥料质量和安全性的底物组成特征及微生物调控机制,有助于丰富植物秸秆堆肥的微生物生态学理论,为提高木质纤维素植物的资源化利用提供理论参考。
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