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随着老年化进程加快,痴呆的患病率急剧上升,相较于我过庞大的人口基数,痴呆逐渐成为我国一个重要的公共健康问题。痴呆主要分为三种类型：阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)、血管性痴呆(vascular dementia,VD)以及混合性痴呆。在全世界的痴呆患者中,血管性痴呆大约占20%；并且在亚洲患血管性痴呆人数已经超过了阿尔茨海默病患者。血管性痴呆患者的5年生存寿命低于阿尔茨海默病,同时老龄化加快心脑血管疾病成为危害国民健康的第一大问题,对血管性痴呆的研究重要性也越发显现。长期以来,广大科研工作者致力于该疾病的机制及防治研究,虽取得了较大进展,但目前仍缺乏有效干预和防治该疾病的药物或措施。黄芩是一味具有悠久历史的传统中药,能清热解毒,燥湿止血。现代的药理学研究表明黄芩还有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等多种药理作用。黄芩苷(Baicalin),黄芩根里提取出来的黄酮类化合物,是比较重要的药理活性成分。在许多的研究显示,黄芩苷具有抗氧化、抗炎等作用,能够改善有心肌缺血损害。目的本实验以缺糖缺氧诱导小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3 cell)损害,建立糖氧剥夺模型(oxygen-glucose deprivation, OGD),模拟脑缺血缺氧损害病理。研究黄芩苷对小鼠脑微血管内皮细胞糖氧剥夺诱导凋亡和坏死的保护作用。方法1.构建糖氧剥夺模型(OGD),将贴壁好的内皮细胞,通过置换无糖培养基,放入定制的无氧装置,运用MTT法检测证明模型建立成功与稳定。2.通过MTT法、LDH法证明黄芩苷对糖氧剥夺诱导细胞损害有保护作用；3.通过流式检测方法检测黄芩苷(100 u M)对糖氧剥夺诱导bEnd.3细胞晚期凋亡、坏死的影响4.透射电镜、Hoechst 33258/PI双染法分别观察黄芩苷对糖氧剥夺诱导bEnd.3细胞损害形态改变影响；5.通过ROS测定验证黄芩苷具有抗氧化作用进一步说明黄芩苷对糖氧剥夺诱导细胞损害的保护作用。结果1.OGD模型构建OGD诱导小鼠脑微血管内皮细胞在2、4、6 h损害明显,在2、4、6 h三个时间的细胞存活率的百分数分别为(x±s)：62.31±2.91、48.32±0.49、36.95±6.46,模型组细胞存活率低于对照组比较(p<0.05)。2.黄芩苷对OGD诱导bEnd.3细胞损伤的保护作用黄芩苷对OGD诱导2、4、6 h bEnd.3细胞损伤的保护作用。在2、4、6 h三个时间点中,模型组细胞存活率低于正常对照组(p<0.05),黄芩苷100 u M和200 uM组,与模型组比较,药物对细胞有明显保护作用(p<0.05)。黄芩苷对OGD诱导2、4、6 h bEnd.3细胞上清液LDH含量影响,与对照组比较,模型组细胞上清液LDH含量增加(p<0.05)、与模型组比较,黄芩苷100 u M和200μM组细胞上清LDH漏出量降低(p<0.05)。特别在诱导6 h后,与模型组比较,用药组细胞上清液LDH含量减少明显(p<0.05)。3.黄芩苷抗凋亡作用：Annexin-V-FITC流式细胞术检测发现,与正常组比较,模型组Annexin-V(+/-)/PI(+)ratio增加明显,细胞晚期凋亡和坏死多,(p<0.05)；与模型组组比较,黄芩苷组Annexin-V(+/-)/PI(+)明显减少,对细胞晚期凋亡和坏死有减少,对细胞有保护作用,有统计学意义(p<0.05)。4.Hoechst 33258/PI荧光双染检测黄芩苷对糖氧剥夺6 h bEnd.3细胞Hoechst 33258/PI荧光双染检测结果：与正常组比较,模型组同时染上两种染料的细胞明显多,表示坏死和晚期凋亡细胞增加；与模型组比较,黄芩苷100μM组细胞双染少,坏死和晚期凋亡细胞少。糖氧剥夺诱导2、4、6 h以及黄芩苷对bEnd.3细胞形态改变实验结果：糖氧剥夺损害2、4、6 h,2、4 h细胞空泡逐渐增多,存在凋亡；6 h细胞质融解,核碎裂细胞坏死。加入黄芩苷100μM细胞形态：细胞膜、细胞核、细胞器完整,与OGD损害6 h比较,细胞形态比较完整,黄芩苷保护作用较明显。5.黄芩苷对OGD诱导6 h bEnd.3细胞内ROS含量结果：OGD 6 h模型组组与正常组比较,ROS含量增加明显；黄芩苷100μM组与模型组比较细胞内ROS产生明显减少。结论1.OGD诱导bEnd.3细胞损害明显,且细胞损害程度随时间增加而损害增加的趋势,OGD诱导损害模型稳定,能达到预期实验损害要求2.黄芩苷能明显减少糖氧剥夺诱导bEnd.3细胞损害的作用,保护作用没有明显的药物剂量依赖的现象。同时能减少细胞上清液中LDH的含量,并且黄芩苷对减少细胞上清液中LDH的含量在糖氧剥夺诱导6 h作用最明显。3.黄芩苷能明显减少糖氧剥夺诱导bEnd.3细胞晚期凋亡和坏死。4.黄芩苷能减少糖氧剥夺诱导bEnd.3细胞坏死,维持细胞生理结构的稳定。5.黄芩苷能明显减少糖氧剥夺诱导细胞内ROS的含量,具有明显的抗氧化作用。黄芩苷减少糖氧剥夺诱导细胞内ROS的含量,减少对bEnd.3细胞的损害。同时,黄芩苷能维持细胞的生理结构稳定,防止细胞质溶解,细胞核碎裂,细胞器肿胀等,减少细胞晚期凋亡和坏死。通过分析本次实验,可发现,黄芩苷对糖氧剥夺诱导bEnd.3细胞的损害的保护作用可能是通过调节细胞晚期凋亡和坏死的变化来实现的,其中ROS的变化参与其中。但是,细胞的存活需要能量供应,在糖氧剥夺的条件下,细胞能量供应不足,而凋亡的级联反应需要在有能量供给充足的条件下才能完成,因此结合已有的结果推断,黄芩苷对糖氧剥夺诱导损害的调节可能是通过调节抑制坏死来实现,可能参与坏死关键蛋白调节,同时对能量代谢也存在影响。