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[研究背景和目的]肿瘤细胞脱离原发灶或转移灶进入血液系统形成循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)。CTCs的发现迄今已有一百多年的历史,并且一直被看作是肿瘤复发和转移的根源。进入血液循环的大多数肿瘤细胞都发生了失巢凋亡,只有少部分得以存活下来。面对极其复杂的机体环境,CTCs是通过何种方式生存下来,又是何种原因促进其获得了凋亡抵抗能力尚不完全清楚。近年来研究显示,白介素-8(interleukin-8, IL-8),又称CXCL8,不仅能够促进肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移及肿瘤血管生成,还能激活细胞内多条生存通路,抑制细胞内凋亡信号。本研究旨在探讨CXCL8与结直肠癌细胞失巢凋亡的关系,分析CXCL8促进结直肠癌细胞抵抗失巢凋亡的分子机制,寻找并试图阻断CXCL8介导的促细胞生存信号的关键靶点,同时检测结直肠癌组织中CXCL8及其下游靶蛋白的表达情况,评价其临床意义,为建立降低结直肠癌复发、转移的新策略提供新的思路。[研究方法]1.CXCL8促进肠癌细胞抵抗失巢凋亡的体外研究(1)失巢凋亡模型构建：应用聚羟乙基异丁烯酸(Poly-HEMA)包被培养板阻止细胞贴壁,将肠癌细胞悬浮培养,模拟肠癌细胞的失巢状态。(2)CXCL8的表达与肠癌失巢凋亡敏感性的研究：应用免疫荧光技术、RT-PCR和Western blot检测多种肠癌细胞系内CXCL8的表达水平。应用FITC-AnnexinV/PI双染法分选凋亡细胞,流式细胞术检测不同时间点贴壁和失巢肠癌细胞的凋亡改变,分析CXCL8与肠癌细胞失巢凋亡敏感性的相关性。(3)CXCL8对肠癌细胞失巢凋亡的影响：以不同浓度的CXCL8分别作用于肠癌细胞系SW480、Caco2,72h后应用AnnexinV-FITC染色试剂盒及流式细胞仪检测肠癌细胞凋亡率的变化,应用噻唑蓝(MTS)实验检测CXCL8作用后失巢和贴壁肠癌细胞的增殖率,应用Western blot检测细胞内凋亡相关蛋白caspase-3和Bc12的表达,初步探讨CXCL8诱导失巢凋亡的机制。再次应用最佳浓度的CXCL8作用于肠癌细胞Lovo、HT29和HCT116,于48h后再次检测细胞凋亡改变,确定CXCL8对肠癌细胞失巢凋亡抵抗的诱导效应。2.CXCL8诱导肠癌细胞失巢凋亡抵抗分子机制的研究(1)Western blot检测CXCL8作用组和空白组肠癌细胞SW480和Caco2内T-AKT、P-AKT、T-ERK、P-ERK、TOPK表达的改变。(2)抑制试验：在加入CXCL8前预先用AKT抑制剂MK2206和ERK1/2抑制剂U0126处理肠癌细胞,应用流式细胞仪FITC-AnnexinV/PI双染法检测肠癌细胞凋亡率,应用Western blot检测细胞内T-AKT、P-AKT、T-ERK、P-ERK和TOPK表达的改变。(3)干扰试验：在CXCL8作用前,分别应用AKT siRNA、TOPK siRNA、 ERK siRNA敲除细胞内AKT、TOPK和ERK基因,应用Western blot检测相关信号蛋白表达的改变,应用流式细胞仪FITC-AnnexinV/PI双染法检测肠癌细胞凋亡率。3.CXCL8和TOPK在结直肠癌组织中表达的临床意义研究(1)免疫组织化学检测肠癌组织及其配对的正常组织内的CXCL8和TOPK的表达。(2)分析CXCL8与TOPK表达的相关性及二者表达与肠癌临床病理的相关性。(3)CXCL8与TOPK表达和肠癌患者生存的相关性。[研究结果]1、CXCL8促进肠癌细胞抵抗失巢凋亡的体外实验(1)在肠癌细胞系内源性CXCL8表达水平与其失巢凋亡敏感性呈负相关,与其贴壁细胞生长凋亡无关。(2)外源性CXCL8能够促进肠癌细胞系抵抗失巢凋亡。(3)CXCL8激活了细胞内PI3K/AKT和ERK1/2信号通路,上调了Bcl2的表达,促进肠癌细胞抵抗失巢凋亡。(4)TOPK是PI3K/AKT与ERK之间的对话参与肠癌细胞的失巢凋亡抵抗。2、肠癌组织表达CXCL8和TOPK的临床研究结果(1)CXCL8和TOPK在肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(x2=53.281,P=0.000；x2=372.000,P=0.000)。(2)在肠癌组织中,CXCL8和TOPK的表达呈正相关(r=0.254,P=0.000)。(3)在肠癌组织中,CXCL8表达与肠癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肝转移相关(P<0.05),TOPK表达与肠癌发生部位、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肝转移、血清CEA水平相关(P<0.05)。(4)Kaplan-Meier生存分析结果显示：CXCL8或TOPK高表达的CRC患者无瘤生存期和总生存期都短于低表达患者,统计学具有显著差异(总生存期：log rank=11.302, P=0.001; log rank=10.620, P=0.001;无瘤生存期：logrank=9.6, P=0.02; log rank=10.502, P=0.001);并且CXCL8与TOPK共表达的CRC患者总生存期及无瘤生存期明显低于CXCL8和TOPK单表达的CRC患者(总生存期：log rank=4.210, P=0.04; log rank=4.386, P=0.036;无瘤生存期：log rank=10.024, P=0.001; logrank=4.662, P=0.032)。(5)多因素Cox回归分析确定了肿瘤浸润深度、淋巴结转移、肝转移、CXCL8与TOPK表达是直接影响结直肠癌总生存期的危险因素；肿瘤浸润深度、CEA、淋巴结转移、肝转移、CXCL8和TOPK表达等6个危险因素直接影响CRC患者无瘤生存期。其中CXCL8与TOPK共表达是直接影响肠癌患者总体生存期(HR:4.393,95%CI:1.524-7.358, P=0.041)和无瘤生存期(HR:3.871,95%CI:1.742-6.558, P=0.018)的独立危险因素。[研究结论]CXCL8能够诱导肠癌细胞发生失巢凋亡抵抗,并且这一效应依赖于细胞内PI3K/AKT和ERK1/2信号通路的激活；TOPK作为PI3K/AKT与ERK1/2之间的一个重要对话参与了肠癌细胞的失巢凋亡抵抗。CXCL8在肠癌复发、转移过程中发挥重要作用,CXCL8和TOPK高表达是肠癌患者预后不良的重要因素。因此,靶向阻断CXCL8相关信号通路可作为一个新的肠癌治疗策略向。