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TA克隆是最简洁、高效的克隆PCR产物的方法之一，在没有合适的酶切位点来进行载体间的DNA片段亚克隆时尤其有用。T载体具有3末端单一的T凸出尾，使其能够直接与3端具有A凸出尾的PCR产物高效连接。常用T载体的不足之处在于需要IPTG诱导和X-gal显色剂，例如蓝白斑筛选；或者菌株生长不稳定，如利用毒蛋白或杀菌肽构建的T载体。最近绿色荧光蛋白(GFP)被用于构架T载体的筛选试剂，插入片段和T载体的重组菌落可以在可见光下进行鉴定，但是仍然需要IPTG诱导。本实验使用一种新型GFP突变体Emerald作为细胞荧光指示剂，构建新型灵敏的T载体。主要结果如下：1、定点突变：定点突变绿色荧光蛋白突变体EGFP(F64L–S65T–H231L)，获得4个氨基酸残基突变的Emerald突变体(S72A, N149K, M153T和I167T)。2、胞外分析：构建大肠杆菌Emerald的表达载体p28SUMO-emerald。表达并纯化重组蛋白Emerald，并分析其紫外可见光谱和荧光扫描光谱性质与报道一致。重组Emerald在Hampton Screen Ⅰ&Ⅱ的第39号条件：2mol/L(NH4)2SO4，0.1mol/LHEPES-NaOH, pH7.5,2%PEG400中晶体生长最优，为柱状晶型。3、胞内分析：Emerald基因连入pUC18载体后，上游添加增强子以增强表达效果，在不加IPTG和X-gal的条件下，37℃培养18小时，大肠杆菌重组菌落在可见光下显示绿色。添加增强子后，菌液每毫克上清总蛋白荧光强度提高至原来的3.3倍。4、同义突变：根据GFP的三维结构预测结果，分别在Emerald突变体第4和第5个β折叠片层结构上选择了2个突变位点，即第93位的V和第109位的R，分别创建SnaBⅠ和SmaⅠ酶切序列。5、T载体构建及验证：构建pESN-T和pESM-T载体。将约500bp外源PCR片段分别与两种T载体连接，重组菌斑为白色，对照在可见光下为绿色。6、插入突变：为了验证T载体的灵敏性，利用定点突变的方法分别在pESN和pESM载体的SnaBⅠ和SmaⅠ酶切位点识别序列中间添加一个三核苷酸序列TCC。平板转化以及菌液上清总蛋白荧光强度分析显示绿色荧光消失，插入突变后的Emerald蛋白在包涵体中表达，折叠性和表达量均受到大幅度影响。综上所述，本文研究了绿色荧光蛋白突变体Emerald在大肠杆菌胞外和胞内性质，选取两个限制性内切酶位点SnaBⅠ和SmaⅠ作为插入位点构建T载体，并构建插入一个三核苷酸序列TCC的突变载体，转化后菌落荧光强度几乎为零，蛋白表达量以及折叠性均大幅度下降。本研究构建的T载体目前最灵敏，具有良好的应用价值。