论文部分内容阅读
油菜(Brassica napus)是我国最重要的油料作物之一,但是其产量受到菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)的严重影响,目前油菜菌核病防卫机制仍不甚了解。研究表明,MPK6是一个关键的植物防御调控因子,已经在拟南芥、水稻、烟草等作物或植物的病害防御中被广泛研究。然而,在B.napus-S.sclerotiorum这一重要的作物-病原菌的互作中,MPK6是否具有防卫作用仍未被研究。本研究采用同源克隆方法从B.napus中克隆得到BnaMPK6的cDNA序列。序列分析显示,BnaMPK6最终的ORF为1134 bp,编码一个含有377个氨基酸残基的蛋白质,其等电点为5.47,相对分子质量为42.89 kDa。序列同源性分析发现,BnaMPK6与拟南芥AtMPK6的一致性为94%。根据B.napus全基因组数据库的Blat分析,BnaMPK6在B.napus基因组中有两个拷贝。BnaMPK6蛋白的中部含有一个TEY motif,表明它属于A组MPKs。Plant-mPLoc分析显示,这个蛋白主要定位于细胞核中。诱导表达实验显示,BnaMPK6对水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)等植物重要的防卫激素显著响应;菌核病侵染后,BnaMPK6显著上调表达,建议BnaMPK6是菌核病胁迫的响应基因,并可能在水杨酸、茉莉酸的防卫信号途径中起作用。为了进一步研究BnaMPK6在油菜抗菌核病中的作用,本研究构建了BnaMPK6过量表达和RNAi抑制表达的植物转化载体,并且通过in planta Agrobacterium-mediated方法转化油菜。通过抗生素筛选,PCR鉴定以及qPCR表达分析获得了4个BnaMPK6过量表达的甘蓝型油菜转化株系(#54、#84、#105和#135)和3个BnaMPK6的RNAi抑制表达的甘蓝型油菜转化株系(#66、#101、#111)。我们从其中分别选择3个过表达株系(#54、#84、#135)和3个抑制表达株系(#66、#101、#111)的T3代植株进行后续实验。S.sclerotiorum接种抗病评价实验显示,BnaMPK6过量表达植株的坏死性病斑面积显著小于野生型植株的,表明BnaMPK6的过量表达显著提高油菜对S.sclerotiorum的抗性,而RNAi抑制表达显著降低抗性。qPCR表达分析显示,S.sclerotiorum侵染后,乙烯信号途径相关基因在BnaMPK6过量表达株系中基本呈现显著上调表达,而在RNAi抑制表达株系中基本呈现下调表达。这些结果表明,BnaMPK6是油菜防卫菌核病侵染的重要的正调控因子。本研究首次报道了MPK6在B.napus-S.sclerotiorum互作中的作用,这些数据将为理解油菜抗菌核病分子机制提供线索,将为运用分子育种方法提高油菜及其它经济作物的菌核病抗性提供基因源。