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背景与目的心肌细胞的大量丢失是很多心脏疾病(如心肌梗死、心力衰竭)的共同病理表现。然而哺乳动物在出生后心肌细胞的增殖能力迅速下降,导致心肌细胞无法得到补充,心脏功能的持续恶化也就难以避免。因此,我们认为成功诱导内源性心肌细胞的增殖将成为修复心脏损伤的潜在途径。本研究拟通过对大鼠心肌细胞转染整合素连接激酶(Integrin-linked kinase,ILK),来观察高表达ILK对大鼠心肌细胞增殖的影响并探讨其主要机制。方法1.通过Western bloting及real-time PCR的方法检测大鼠不同生长发育阶段心脏中ILK的表达情况。2.通过胰酶、胶原酶Ⅱ联合消化法,获取出生2天SD大鼠心肌细胞,将培养的心肌细胞随机分为GFP对照组及ILK转染组,分别转染Ad-GFP和Ad-ILK,继续培养48h后,通过Western bloting以及流式细胞术确定转染成功;采用直接计数法及MTT法计数心肌细胞的数量,用EDU法来检测心肌细胞DNA的合成,并通过免疫荧光法检测心肌细胞内Ki-67、H3P(ser10)等蛋白的表达来反映心肌细胞核的分裂、免疫荧光法检测AuroraB蛋白的表达来反映心肌细胞胞质的分裂。3.流式细胞术检测心肌细胞周期及心脏干细胞(Cardiac stem cells,CSCs)的数量变化;通过Western bloting检测心肌细胞中 ILK 下游的 AKT、P-AKT(ser473)、GSK-3β、P-GSK-3β(ser9)、cyclinD1等蛋白的表达情况,探讨心肌细胞高表达ILK后增殖能力增强的机制。结果1.胚胎期大鼠心肌组织中ILK的表达最高,出生后ILK的表达迅速下降,至2个月左右趋于稳定。2.直接计数法及MTT法检测发现心肌细胞转染Ad-ILK后细胞绝对数量显著增加;Ad-ILK组心肌细胞DNA的合成、反映细胞核分裂的Ki-67、H3P(ser10)以及反映胞质分裂的AuroraB蛋白表达均显著增加;同时,心肌细胞周期检测也显示Ad-ILK组处于S/G2/M期的心肌细胞明显增多;进一步的研究发现PKB/Akt通路抑制剂可以抑制ILK诱导的心肌细胞增殖,而Erk1/2通路抑制剂无此效应。3.Western bloting检测显示,与对照组相比,Ad-ILK组心肌细胞内AKT(ser473)、GSK-3β(ser9)磷酸化水平及cyclinD1蛋白表达水平明显升高;另外,流式细胞术检测发现,在我们的培养体系中c-kit+的心脏干细胞数量并没有发生明显变化。结论高表达ILK可以促进哺乳动物心肌细胞增殖,这一作用可能与ILK激活心肌细胞内的PKB/Akt/GSK-3β/cyclinD1信号通路有关。因此,利用ILK来促进内源性心肌细胞的增殖将很可能为心脏修复领域提供一种新的治疗方法.背景与目的心脏纤维化是心脏病理性重构的一个重要构成部分,在高血压、心肌梗死、心力衰竭等多种心血管疾病中广泛存在,可引起心功能不全、心律失常,甚至心脏性猝死,严重威胁人类健康。研究表明心脏成纤维细胞的激活和分化,导致胶原合成增多、比例失调以及排列紊乱是引起心脏纤维化的关键因素。二甲双胍是临床上常用的降糖药物,主要通过增加胰岛素敏感性、减少肝葡萄糖输出来降低血糖。近些年来的研究证明,二甲双胍还具有不依赖于降糖效应的直接心脏保护作用,但其对心脏成纤维细胞的分化是否具有影响,目前尚不清楚。因此,本研究以成年大鼠心脏成纤维细胞成为研究对象,观察二甲双胍对AngⅡ诱导的心脏成纤维细胞分化的影响并深入探讨其机制。方法通过胰酶、胶原酶Ⅱ联合消化法,获取成年SD大鼠心脏成纤维细胞,并建立血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的心脏成纤维细胞分化模型。予不同浓度的二甲双胍预处理细胞,24小时后,分别使用Western bloting及免疫荧光染色检测α-SMA的表达、real-time PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达。为明确PKC-NADPH氧化酶-ROS通路在Ang Ⅱ诱导的心脏成纤维细胞分化中的地位,我们使用N-乙酰半胱氨酸(NAC)清除细胞内ROS,用calphostin C、apocynin分别抑制PKC和NADPH氧化酶的活性,并检测对Ang Ⅱ诱导的心脏成纤维细胞分化的影响(检测α-SMA和Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达)。最后,通过DCF法检测细胞内ROS、NADPH氧化酶活性试剂盒测定细胞NADPH氧化酶活性、Western bloting分别检测细胞中PKC α、PKC β、PKC δ、PKC ε等蛋白的膜转位情况,探讨二甲双胍对PKC-NADPH氧化酶-ROS通路的抑制作用。结果我们的研究发现:Ang Ⅱ(100nM)持续刺激可以诱导心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞分化(主要表现为α-SMA和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达增加),而二甲双胍可以呈浓度依赖性的抑制Ang Ⅱ诱导的心脏成纤维细胞分化。进一步的研究发现使用NAC、calphostin C和apocynin预处理均可明显减少Ang Ⅱ诱导的细胞内ROS产生,并能抑制Ang Ⅱ诱导的心脏成纤维细胞分化。此外,Ang Ⅱ刺激心脏成纤维细胞可以诱导PKC ε的激活(对其他PKC亚型无激活作用),而二甲双胍预处理能显著抑制PKC ε的激活,进而抑制其下游的NADPH氧化酶活性,并最终导致细胞内ROS生成减少。结论二甲双胍能够抑制Ang Ⅱ诱导的心脏成纤维细胞分化,这一作用主要与二甲双胍抑制PKC-NADPH氧化酶-ROS通路的激活有关。因此,这一研究为二甲双胍的心脏保护作用提供了新的理论支持,也为治疗心脏纤维化提供了新的策略。