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目的:建立一种更加稳定且适用于不同物种的乳酸脱氢酶同工酶分离技术方法:设计并组装自动化恒温温控系统监测电泳系统温度,联合冰水浴设置一系列电泳温度,以探究不同电泳液温度对乳酸脱氢酶同工酶酶谱检测的影响并选择其最佳温度;通过pH计设置一系列电泳液pH值,以探究其对乳酸脱氢酶同工酶酶谱检测的影响并选择其最适电泳液pH值;通过数据库预测数据及实验结果比对,探究不同物种酶谱迁移率差异的原因;设置不同电泳液进行电泳,以探究电泳液对乳酸脱氢酶同工酶酶谱检测的影响。结果:冰水浴电泳组检测到完整的5条酶带,而常温电泳组仅检测到4条酶带,其LDH5失活;恒温系统协助温控组(10℃)温度波动在2℃以内,可见完整的5条酶带,且各酶带间分离良好,无酶带滞留于凝胶孔道,而常温电泳组,温度波动在10℃以上℃,LDH5失活,LDH4滞留于凝胶孔道;10℃恒温组酶带完整,各酶带间分离良好,无凝胶孔道滞留现象,15℃、20℃、25℃恒温组均出现不同程度酶带失活、分离不佳及孔道滞留现象;电泳液温度变化5℃,LDH5的迁移率明显变化,且LDH5活性随温度升高降低。各酶带的迁移率随电泳液pH的变化而变化,当pH为8.3或8.6时,各酶带之间间距最大,分离效果最好,且LDH3和LDH4均远离点样孔,无孔道滞留现象;随着电泳液pH值的增加,孔道偏负极侧的酶带更加远离点样孔,相反,随着电泳液pH值的降低,孔道偏阳极侧的酶带更加远离点样孔;最后,随着实际电泳液pH值逐渐偏离其工作pH值,电泳液电流逐渐增加,而各酶带的活性逐渐减弱;大鼠各酶带迁移率及酶活性变化与人类的基本一致,而小鼠的却相差甚远;通过NCBI蛋白质数据库与ExPASy数据库所得各酶理论PI值与所得酶谱结果相符,即人类和大鼠各酶带具有相同的迁移率,在酶谱图中处于同一水平位置,而小鼠则显著不同,其差异与理论预测值相符。巴比妥缓冲液组发热明显,电流大,恒温系统甚至不能恒定控制其温度,所得酶谱结果各酶带不同程度失活,而TBE缓冲液组发热效应小,电流小,恒温系统可稳定控制其温度在10℃,所得酶谱完整且分离效果良好。改良的技术方案可检测不同物种和样品类型的酶谱,并可进行定量分析。结论:电泳液低温恒温对酶谱结果的稳定性至关重要,以10℃为宜。电泳液的pH值显着影响酶带的迁移率及活性,不同实验物种应个性化选择电泳液pH值,实际pH值应接近工作pH值;当孔道偏负极侧的酶带滞留时,略微增大pH值可改善,反之,当孔道偏正极侧的酶带滞留时,略微减小pH值可改善。Marker选择以同一物种中5种酶带均能清晰检测的样本为宜,可混合同一物种不同样本实现此目的;其次在已知酶谱差异的情况下,也可使用不同物种的样本作为Marker。聚丙烯酰胺凝胶电泳法不适用于酶谱法的推广,琼脂糖凝胶电泳法更适于推广使用。电泳液选择时以工作pH匹配,电泳热效应小为宜。