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(一)靶向载多西紫杉醇脂质微泡的制备及性质测定目的:制备靶向载多西紫杉醇微泡,连接肿瘤血管内皮细胞特异性的CD105单克隆抗体。方法:本研究采用改良薄膜水化、机械振荡法制备载多西杉醇脂质超声微泡(Docetaxel Loaded Lipid Microbubble,DLLM)。通过生物素-链亲和素连接载药脂质体微泡(DLLM)以及CD105单克隆抗体,得到靶向载多西紫杉醇微泡(CD105-DLLM)。随后进行了以下性质测定:1.靶向载多西紫杉醇微泡特征和性质测定:冻干机冻干后,扫描电镜(SEM)下观察;采用粒度分析仪测量微泡粒径,将微泡按一定比例稀释,水浴超声分散30 min,测量微泡粒径;2.CD105-DLLM包封率和载药量测定:使用反相高效液相色谱(HPLC)法检测包封率、载药量;3.CD105-DLLM的体外释药测定:通过制备模拟体液,将CD105-DLLM装入透析袋,分为UTMD(Ultrasound Targeted Microbubble Destruction,超声靶向微泡破坏技术)组、自然释放组,进行体外释药测定,浓度由HPLC法测得;4.CD105-DLLM稳定性初步考察:将新鲜制备的CD105-DLLM冻干后,分别保存在冷藏(2-8℃)或常温环境下,之后每日取少量微泡,并观察微泡并照片,同时检测包封率和载药量。结果:1.一般形态观察:扫描电镜(SEM)下,CD105-DLLM形态规则,外形圆整,分散好,未见明显粘连,粒径分布均匀。平均粒径:3220±1570 nm。2.HPLC法测定CD105-DLLM包封率及载药量:测得包封率为80-86.5%,载药量18.5-23%。3.稳定性实验结果:4℃下存放微泡为适宜温度,微泡宜新鲜制备。4.HPLC法测得在48h内,CD105-DLLM+UTMD组在超声爆破后得以完全释放,药物释放率达到100%,达到快速释放的目的。结论:本部分实验制备了一种靶向微泡-将多西紫杉醇包封于脂质体中并连接CD105抗体,制备了稳定性较好,包封率、载药量均较高的CD105-DLLM,还能在UTMD介导下能够达到快速释放的目的。(二)UTMD介导下靶向载多西紫杉醇脂质体微泡(CD105-DLLM)对人肝癌细胞MHCC-H的增殖抑制作用及靶向能力测定目的:通过体外细胞及荷瘤动物体内实验,探讨由CD105单克隆抗体标记的载多西紫杉醇脂质体微泡(CD105-DLLM+UTMD)对人肝癌细胞MHCC-H的靶向能力;通过离体(细胞)及在体(动物)实验,明确CD105-DLLM+UTMD对人肝癌细胞MHCC-H的增殖抑制效果。方法:体外培育MHCC-H肝癌细胞系。细胞培养条件:37℃、5%CO2、饱和湿度,含10%胎牛血清的DMEM-HG培养,隔日换液,90%融合时传代。待细胞生长状态稳定时进行实验,分为四组:Control,DOC,DLLM,CD105-DLLM+UTMD。对不同组别细胞分别进行以下测定:1.CD105-DLLM体外寻靶实验:分别使用Cy3-PEG-Biotin标记CD105-DLLM、DLLM,选取处于对数生长期的MHCC-H细胞,置于6孔板中爬片生长后染色后,激光共聚焦显微镜(LSCM)下观察微泡对肝癌细胞的体外靶向能力,用IPP7.0分析软件进行数据分析统计。2.体外细胞活力、增殖抑制实验。用CCK-8法检测四组不同方式对人肝癌细胞MHCC-H增殖抑制作用,具体包括:(1)通过CCK-8法测定不同处理方式对人肝癌细胞MHCC-H细胞活力的影响;(2)通过CCK-8法测定不同处理方式对人肝癌细胞MHCC-H增殖的作用。3.荷瘤裸鼠体内CD105-DLLM寻靶实验:采用快速种植法建立荷瘤裸鼠模型。建模成功后,分别向裸鼠尾静脉注入Cy-3标记CD105-DLLM后给予UTMD和Cy3标记的DLLM;将麻醉好的荷瘤裸鼠置于小动物活体成像系统实验台内,检测Cy-3染料标记CD105-DLLM在荷瘤裸鼠体内发光情况;(2)观察不同处理方式对荷瘤裸鼠生存时间的影响,绘制生存曲线图;(3)检测、观察不同组别中荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响,并用超声二维成像、小动物活体成像系统对裸鼠体内CD105-DLLM联合UTMD后的情况进行图像采集、分析。结果:1.体外细胞活力结果显示:CD105-DLLM+UTMD组在4h后其细胞活力的抑制作用显著强于其它各组(P<0.01);2.细胞增殖抑制实验结果表明:CD105-DLLM+UTMD组在各时间点内对人肝癌细胞MHCC-H的增殖抑制作用均明显高于其它各组(P<0.01)。3.通过免疫荧光实验观察到CD105–DLLM在体外具备良好的靶向性。4.荷瘤裸鼠体内实验:(1)HE染色结果示成功建立MHCC-H荷瘤裸鼠模型;(2)体内动物寻靶能力测定结果:小动物活体荧光成像发现,CD105-DLLM组可检测到红色荧光聚集于肿瘤部位,而Control组无法检测到区别于背景的红色荧光区域,证实了CD105-DLLM在荷瘤裸鼠体内也具有良好的靶向性;(3)对各组的荷瘤裸鼠进行了生存曲线对比。结果显示,CD105-DLLM+UTMD组裸鼠较Control组相比,生存时间明显延长。(4)超声二维图示CD105-DLLM+UTMD组裸鼠肿瘤体积相对Control组,肿瘤体积明显减小。结论:1.CD105-DLLM+UTMD能够降低人肝癌细胞MHCC-H细胞活力;2.CD105-DLLM+UTMD对MHCC-H细胞具有增殖抑制作用;3.CD105-DLLM在体外(细胞)、体内(荷瘤裸鼠)均具备靶向能力。(三)UTMD介导下CD105-DLLM对人肝癌细胞MHCC-H增殖抑制、凋亡的作用机制目的:探讨UTMD下的CD105-DLLM对于人肝癌细胞MHCC-H的作用,研究其细胞周期、细胞凋亡、凋亡相关蛋白的影响,探索凋亡相关机制。方法:将对数生长期MHCC-H细胞分为四组:空白微泡(CON),单纯多西紫杉醇(DOC),载多西紫杉醇微泡(DLLM),靶向载多西紫杉醇脂质微泡并以超声爆破(CD105-DLLM+UTMD)组:1.用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡周期;2.用TUNEL检测各组MHCC-H细胞的凋亡,用IPP7.0软件选取凋亡细胞,计算凋亡细胞百分比;3.Western blotting检测各组凋亡相关蛋白Bax,Bcl-2,Cyto-c,P53,Caspase-3表达的变化、蛋白含量;4.激光共聚焦显微镜(LSCM)下观察人肝癌MHCC-H活细胞中Caspase-3含量及细胞形态变化。结果:1.流式细胞仪检测结果显示:CD105-DLLM+UTMD显著抑制分裂期细胞比例。CD105-DLLM联合超声靶向释药显著抑制肝癌细胞MHCC-H分裂期细胞比例,能在抑制肝癌细胞增殖的同时显著增加MHCC-H细胞凋亡率;2.TUNEL原位凋亡检测显示CD105-DLLM诱导人肝癌细胞MHCC-H凋亡;3.CD105-DLLM+UTMD组中,Cyt-c、Bax/Bcl-2、P53的表达均显著高于其他各组(P均<0.01),而在Caspase3的激活实验中,发现DOC组及CD105-DLLM+UTMD组均可引起Caspase 3的大量激活,以CD105-DLLM+UTMD引起的Caspase-3数量更为显著。4.通过LSCM观察活细胞Caspase-3的含量,在5h内细胞核中可见Caspase 3激活产生的绿色团块(凋亡细胞)出现并逐渐增多,而细胞质及细胞形态无变化;5h后细胞核内绿色团块继续增加、细胞质内逐步出现绿色凋亡小体;在作用10h后,CD105-DLLM+UTMD组出现了明显的Caspase-3移位,多数激活的Caspase-3转移至细胞膜表面。结论:在该试验条件下,UTMD介导的CD105-DLLM可通过抑制增值期细胞比例来抑制肝癌细胞增殖,同时激活了凋亡同路并诱导人肝癌细胞MHCC-H发生凋亡、引起了Caspase-3激活及移位,从而发挥其肿瘤抑制作用。小结:本实验将多西紫杉醇包封于脂质体中并连接CD105抗体,制备了稳定性较好,包封率、载药量均较高,在UTMD介导下能够快速释放的靶向载药脂质超声微泡。通过对各组人肝癌细胞MHCC-H的细胞活力、细胞增殖水平的测定发现:CD105-DLLM+UTMD能够明显降低MHCC-H细胞活力、对MHCC-H细胞具有增殖抑制作用;通过寻靶实验,验证了CD105-DLLM在体外(细胞)、体内(荷瘤裸鼠)均具备靶向能力;活细胞检测结果显示:由UTMD介导的CD105-DLLM引起了Caspase3激活及移位、可诱导MHCC-H肝细胞发生凋亡,Western blotting检测所示Cyto-c和Caspase-3在细胞凋亡过程中发挥着重要作用。