Wnt信号通路是调控细胞生长增殖的关键途径，在胚胎发育和肿瘤发生中起着重要作用。β-catenin是经典Wnt通路中关键的胞内效应分子，它进入细胞核后通过与LEF/TCF家族的转录因子结合，进而调控特定基因的表达。β-catenin在胞内主要受APC-Axin-GSK-3β多蛋白复合体的调制；其中GSK-3β即糖原合酶激酶3β的主要作用是使游离的β-catenin磷酸化，使其进入泛素一蛋白酶体系统而被降解，Wnt蛋白等即通过对GSK-3β等的抑制，引起胞浆内游离β-catenin的升高而激活该途径。 在哺乳类神经系统，Wnts基因对神经管和神经嵴细胞增殖、凋亡及命运决定的调控作用几年来逐步受到关注，近年还有证据显示Wnt家族在突触形成与皮层模式的发生中也扮演了重要角色。迄今已有研究较多是侧重于神经系统发育早期Wnt蛋白家族本身的表达与功能作用，有关Wnt信号途径下游分子β-catenin、GSK-3β等在神经系统发育特别是生后过程中的变化则报道极少，而近年已有研究显示此类分子不仅调控神经发生，同时也参与了神经系统可塑性以及神经退行性变等过程。神经干细胞(NSCs)作为神经系统的原基细胞，有关其增殖及分化机制的研究是近年神经科学广受关注的焦点领域；目前对Wnt/β-catenin信号途径在NSCs增殖、分化与细胞命运决定等过程中的作用，文献报道存在较大差异，有基于基质干细胞、Wnt信号分子基因敲除及成体脑组织的观察，显示Wnt通路的激活即β-catenin信号能促进干细胞包括NSCs的增殖并阻抑其分化，而有在神经嵴细胞及皮层前体细胞的研究则报道Wnt信号主要是NSCs的一个分化诱导因子，也有认为wnt/β-catenin通路对NSCs增殖分化的调控可能具有区域与发育时段特异性；此外，有关Wnt信号途径与胚胎干细胞神经分化的关系也有不同报道;还有研究认为Wnt信号对NSCs增殖分化的调控有赖于与BMP等信号的协同。故对此途径的深入研究不仅有助于阐明NSCs的增殖分化机制，还将可能为NSCs供源的获取及促进神经发生提供新的线索。神经管缺陷(NTD)是神经管发生过程中的常见畸形，已经确定NTD发生中存在着NSCs的增殖受阻，有关Wnt信号分子在神经管和NTD发生过程中的改变及其可能作用，值得深入探讨。 本研究采用免疫组织化学染色和免疫组化双标记、细胞培养、WesternBlot等技术，结合流式细胞检测、图像分析及统计学分析等手段；在体研究了Wnt信号通路关键效应分子β-catenin在成年大鼠脑组织的表达分布及其在生后发育过程中的变化；并同时观察了Wnt信号通路GSK-3β、APC等调节分子在大鼠脑内的分布与细胞定位。在离体培养条件下，首先检测了NSCs分化过程中上述Wnt信号分子表达的动态变化；重点观察了GSK-3β抑制剂氯化锂(LiCl)对NSCs细胞周期动力学等的影响以及β-catenin等信号分子的表达改变；此外还结合细胞周期等检测，比较了正常及NTD胚胎脑组织中Wnt信号分子的差异。以探讨Wnt信号分子在脑发育、特别是NSCs增殖分化中的作用。主要结果如下： 一、Wnt信号分子在大鼠脑组织的表达定位及其在发育过程中的变化 1.免疫组织化学结果显示β-catenin在成年大鼠脑内主要分布于皮层锥体细胞层、海马、室下层、丘脑及纹状体等区域，阳性细胞多为有突起的神经元样，在密集表达的室下区及背侧丘脑近脑室等处，β-catenin有明显的细胞核内定位；新生大鼠β-catenin在脑内呈散在分布，P3至P20β-catenin表达逐步增多，主要存在于新皮层、丘脑及室下层区域，尤其在扣带后皮质，纹状皮质，梨状前皮质等处；老年大鼠脑内β-catenin的表达分布基本与成年相似，但阳性细胞数量及强度显著低于成年。提示β-catenin在CNS生后发育、特别是神经元功能活动中可能具有重要作用，同时也提示其与神经发生存在密切关系。 2.GSK-3β阳性细胞多为具有突起的神经元样细胞，其主要分布区域包括新皮层、海马、背内侧丘脑、小脑浦肯野细胞及脑干多个核团等，髓质区域呈现阴性。GSK-3β、APC与β-catenin在空间分布模式上表现高度一致性。双标记实验显示β-catenin与APC除神经元外，在部分星形胶质细胞也存在表达，而GSK-3β则主要显示神经元定位；部分β-catenin阳性细胞，特别是室下层及海马区阳性细胞还呈现与神经前体细胞标记物nestin的共存。结果提示Wnt信号途径分子在脑内存在着密切相关的功能联系，同时在不同细胞及组织区域可能还具有其特有的生物效应，对其相关信号机制有待深入研究。 3.Westernblot结果显示β-catenin在大鼠皮层生后发育过程中存在持续表达，表达高峰主要在P3和P21两个时相，成年皮层组织内β-catenin的表达量处于相对低点。成年皮层组织内β-catenin表达约高于同期海马；同时成年海马区β-catenin印迹呈现双带，提示其可能存在着不同的磷酸化状态。Western印迹获得的皮层β-catenin变化与免疫组化染色结果基本一致。 二、Wnt信号分子对培养神经干细胞增殖和分化的影响 1.采用原代培养方法自胚胎14-16天大鼠皮层获得含大量细胞团的NSCs体系，细胞成悬浮球团状生长。免疫细胞化学染色显示细胞团及散在的单个细胞多呈nestin阳性；诱导分化后鉴定显示细胞具有多向分化潜能。本实验主要使用了传代3-4代的细胞体系。 2.应用含10％胎牛血清培养液诱导NSCs分化，WesternBlot检测了NSCs在加入胎牛血清12h、24h、48h、72h后β-catenin和GSK-3β在分化过程中的动态变化，结果显示两者存在持续表达，β-catenin表现逐渐减少趋势，而GSK-3β则逐渐增加。提示Wnt/β-catenin通路与NSCs的分化过程密切相关，呈现了一个由活跃到逐步抑制的过程。 3.应用分离培养的NSCs体系，观察了不同浓度的GSK-3β抑制剂氯化锂(1，5，10,40mmol/L)处理4d后NSCs细胞周期等生物学性状改变，结果显示氯化锂能促进培养NSCs的增殖，流式细胞仪检测表现为S期、G2/M期细胞比例的增多和G1期相对减少，其效应呈现一定的剂量依赖关系；氯化锂处理后的NSCs体系细胞团块分散，呈悬浮状态生长，并能抑制血清诱导下的干细胞分化，分化细胞贴壁时间明显延长。蛋白印迹检测显示NSCsβ-catenin在氯化锂处理后表达明显下调，表现负相关的量效关系。提示Wnt信号途径的激活能促进培养NSCs的增殖，抑制干细胞分化，其作用可能与胞内效应分子β-catenin的增多有关。 4.采用孕鼠(E7.5d)腹腔内甲醇注射，获得了神经管缺陷(NTD)胚胎小鼠，解剖镜下E10.5d甲醇注射组鼠胚死胎明显增多，形态多样；典型的形态畸形包括颅脑顶部未闭、后脑及面部异常、脊柱或尾部有裂口及无尾或短尾等。选用典型畸形者用于分离制备脑泡及脊髓神经组织细胞悬液，部分用于提取组织总蛋白。 5.流式细胞仪检测显示与正常对照比较，NTD鼠胚神经组织处于G0/G1期细胞百分比明显增高，处于S期细胞百分比明显降低；即呈现神经上皮G1期的阻滞。WesternBlot检测发现NTD鼠胚神经组织中β-catenin表达明显减少，而GSK-3β表达相对增多。提示Wnt/β-catenin通路与神经管形成密切相关并可能通过对NSCs增殖分化的调控参与了NTD的发生。