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IFITM蛋白(Interferon-induced transmembrane protein)是一类干扰素诱导的小跨膜蛋白,分子量约为17 kDa。在人细胞中至少有五个成员:IFITM1、2、3、5和10。IFITM5只在骨细胞中表达,而IFITM10的功能尚不明确。其他3种IFITM蛋白普遍表达于人体内各种细胞中,且强烈响应干扰素的激活。近年来的研究主要关注于IFITM蛋白的抗病毒功能。最初的siRNA筛选实验表明IFITM蛋白可以抑制流感病毒,西尼罗河病毒及登革热病毒。迄今为止,已发现IFITM蛋白能够抑制一系列高致病性病毒,如:丝状病毒、SARS病毒、HIV-1等。对IFITM3的转录后修饰研究证明,IFITM3能够被泛素化及棕榈酰化修饰,且这些修饰以不同的方式调节IFITM3的细胞定位及其抗病毒功能。虽然对IFITM3抗病毒机制的研究已经将靶点锁定在病毒的进入过程,但具体机制尚不明晰。 本实验室前期研究及相关报道表明,IFITM3的N端21个氨基酸对IFITM3抑制携带VSV G包膜蛋白的病毒至关重要。本文以此为基础,通过分析该区域的氨基酸序列,发现在IFITM3的N端存在一段特殊的序列20-YEML-23。该序列符合YxxΦ模序的特点,此模序在细胞中主要介导膜蛋白通过胞吞途径由细胞膜向内体系统转运。YEML序列的突变使IFITM3丧失了对pH依赖型病毒的抑制作用,而抑制pH非依赖型病毒的能力没有受到影响。 为了证明IFITM3中的YEML序列的确是一个有功能的YxxΦ模序,我们首先进行了抗体摄取实验,结果表明细胞表面分布的IFITM3能够通过某种机制被转运至内体系统中;随后的胞吞抑制剂实验,证明IFITM3向内体的运输主要通过网格蛋白依赖型的胞吞作用。通过免疫共沉淀、免疫荧光及相关点突变实验,我们找到了介导IFITM3向内体运输的适配体蛋白AP-2复合物,且发现AP-2复合物中μ2亚基的无功能突变或siRNA敲低,均干扰了IFITM3的内体定位。同时发现YEML序列突变后,IFITM3主要分布于细胞膜,不能被转运至内体,且丧失了与μ2亚基的相互作用。上述结果表明IFITM3的YEML序列确实作为YxxΦ模序发挥作用,介导AP-2复合物对IFITM3的识别与内体转运。 此外,我们发现YEML模序中的酪氨酸能够被磷酸化修饰,且该酪氨酸是IFITM3中唯一的酪氨酸磷酸化位点。通过激酶抑制剂实验,我们确定催化IFITM3酪氨酸磷酸化的激酶属于Src激酶家族。接下来,通过免疫共沉淀实验和免疫荧光实验,我们发现Src激酶家族中的一个成员Fyn同IFITM3存在相互作用。过表达Fyn可以增强IFITM3的磷酸化修饰;而下调Fyn的表达或将Fyn的催化中心突变,均使IFITM3的磷酸化水平减弱。以上结果证明,IFITM3第20位酪氨酸能够被磷酸化修饰,且Src激酶家族的Fyn为催化这一位点磷酸化的激酶。 综上所述,本文首次报道20-YEML-23作为内体分选信号,调节了IFITM3在细胞膜与内体系统之间的转运,该模序对IFITM3抑制pH依赖型病毒的感染具有重要意义。此外还发现此模序中的Y20可以被磷酸化修饰,且此磷酸化修饰可能通过改变AP-2复合物对20-YEML-23模序的识别,影响IFITM3的内体定位及其抗病毒功能。