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目的创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）是一种高致残率和高致死率的疾病,导致严重的神经功能障碍,目前尚缺乏有效治疗继发性脑损伤的方法。研究表明,长链非编码RNA（long non-codingRNA,LncRNA）在中枢神经系统（central nervous system,CNS）发育及其病理生理过程中发挥着重要的作用。前期研究表明LncRNA-AK046375在小鼠TBI 24 h后创伤周围皮层组织中表达明显升高,说明其可能在调控TBI后的病理生理过程中发挥着重要的作用。微小RNA（microRNA,miRNA）通过与其靶基因信使RNA（messengerRNA,mRNA）的3’-端非翻译区域（3’-untranslated region,3’-UTR）结合进而抑制mRNA的翻译,使靶基因的表达减少。研究表明,LncRNA可通过吸附miRNA,使miRNA对其靶基因的抑制减弱,进而使该基因的表达增加,最后发挥其生物学功能。金属硫蛋白2（metallothionein 2,MT2）具有分子量小,富含半胱氨酸,其富含半胱氨酸的特点赋予其较强的抗氧化能力。本实验采用小鼠TBI模型及H2O2诱导体外氧化应激模型,来探究LncRNA-AK046375的神经保护作用及其可能机制。方法1.构建LncRNA-AK046375过表达及其空载腺病毒、LncRNA-AK046375敲低及其空载腺病毒。分别通过小鼠侧脑室注射腺病毒,在注射腺病毒7天后行控制性皮质损伤（controlled cortical impact,CCI）建模,进而模拟小鼠TBI的病理生理状态。C57BL/6J小鼠（237只,8-12周龄）被随机分为假手术组（n=39,）、TBI组（n=39）、LncRNA-AK046375过表达+TBI组（n=39）、LncRNA-AK046375过表达空载+TBI组（n=39）、LncRNA-AK046375敲低+TBI组（n=39）及LncRNA-AK046375敲低空载+TBI组（n=39）,除假手组仅行开骨窗处理外,其余各组均行开骨窗和CCI建模,本实验取3只小鼠行侧脑室注射腺病毒观察腺病毒在脑皮层中的转染情况。采用神经损伤严重程度评分（neurological severity scores,NSS）、抓线实验、转棒实验、水迷宫实验检测LncRNA-AK046375对TBI后小鼠的运动功能、学习和记忆能力的影响。建模后7天,采用实时定量-聚合酶链式反应（quantity polymerase chain reaction,q-PCR）检测腺病毒的转染效率;采用免疫荧光检测Neu N阳染的细胞数量;采用western blot检测紧密连接蛋白（occludin,claudin 5及ZO1）、凋亡相关蛋白（BCL-2、Bax、cleaved-caspase3）及线粒体内外cytochrome C的表达;采用伊文氏蓝渗透实验及干湿重法间接检测血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）的完整性;采用一步法TUNEL试剂盒检测创伤区及周围皮层细胞的凋亡。2.构建小鼠海马神经元细胞系（HT22）LncRNA-AK046375过表达模型,收集样本总的RAN进行转录组高通量测序,来预测LncRNA-AK046375发挥的生物学功能及其介导此功能的中间介质。采用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）检测LncRNA-AK046375在小鼠原代皮层神经元及星形胶质细胞的亚细胞定位;采用LncRNA-AK046375过表达和敲低腺病毒及其空载腺病毒分别转染原代皮层神经元和星形胶质细胞,采用q-PCR、Western blot及免疫荧光检测检测LncRNA-AK046375及MT2的表达。3.采用H2O2浓度梯度法构建小鼠原代皮层神经元和星形胶质细胞氧化应激模型,采用CCK-8检测细胞活力,活性氧（reactive oxygen species,ROS）试剂盒检测细胞内活性氧水平,综合以上结果确定原代皮层神经元及星形胶质细胞的H2O2造模条件。为探究LncRNA-AK046375对H2O2造模后原代皮层神经元和星形胶质细胞的作用,采用western blot及试剂盒检测氧化应激相关蛋白丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase-2,SOD2）、过氧化氢酶（catalase,CAT）、谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、GSH/GSSG的表达,Mito SOXred染色检测细胞内的氧化应激水平;采用western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、Bax、cleaved-caspase3及线粒体内外cytochrome C的表达,采用一步法TUNEL试剂盒检测细胞凋亡。4.既往研究证实,LncRNA可以通过吸附miRNA来实现对靶基因mRNA的调控,通过查找“microrna.org”数据库并整合“mi Randa”、“PITA”和“RNAhybrid”三个RNA互作序列分析软件综合运算结果,预测本实验可能涉及的miRNAs;采用双荧光素酶实验验证预测的miRNAs是否直接与MT2 mRNA结合;采用q-PCR和western blot检测原代皮层星形胶质细胞转染miRNA-491-5p mimics或inhibitor后MT2的表达;采用CCK-8和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）释放实验检测miRNA-491-5p对H2O2造模后原代皮层星形胶质细胞的作用;采用Mito SOXred染色检测H2O2造模原代皮层星形胶质细胞后细胞内的氧化应激水平。采用Ago2-RNA结合蛋白免疫共沉淀（Ago2-RNA Binding Protein Immunoprecipitation,Ago2-RIP）和双荧光素酶实验验证LncRNA-AK046375和miRNA-491-5p能否直接结合。提取原代皮层星形胶质细胞,根据转染腺病毒,miRNA-491-5p mimics或inhibitor的不同,将其分为正常组,LncRNA-AK046375过表达组,LncRNA-AK046375过表达+miRNA-491-5p mimics组,LncRNA-AK046375敲低组和LncRNA-AK046375敲低+miRNA-491-5p inhibitor组,采用q-PCR和western blot检测LncRNA-AK046375和miRNA-491-5p对MT2表达的调控关系。结果1.成功在小鼠脑组织内构建了小鼠LncRNA-AK046375过表达及敲低模型。与过表达空载组相比,LncRNA-AK046375过表达能明显改善TBI后小鼠的神经运动、记忆和学习功能;而与敲低空载组相比,LncRNA-AK046375敲低能明显加重TBI后小鼠的神经运动、记忆和学习功能障碍。TBI后7天,与过表达空载组相比,LncRNA-AK046375过表达能明显减少伤灶及其周围细胞的凋亡,减少皮层神经元的丢失,减少精密连接蛋白的丢失,减少伊文氏蓝的渗出,减少脑含水量;与敲低空载组相比,LncRNA-AK046375敲低能明显增加伤灶及周围细胞凋亡,增加皮层神经元的丢失、伊文氏蓝的渗出、脑含水量和精密连接蛋白的丢失。2.本次测序共发现1342条mRNA因HT22细胞内LncRNA-AK046375的过表达而显著改变,717条mRNA表达水平显著上调,625条显著下调,其中MT2的mRNA变化幅度最大。离体实验再次证实LncRNA-AK046375能使MT2表达增加。3.FISH探针实验证实LncRNA-AK046375在小鼠原代皮层神经元和星形胶质细胞的胞浆和胞核均有表达,但主要分布于胞浆。确定诱导小鼠原代皮层神经元及星形胶质细胞的氧化应激模型的H2O2条件（神经元:200μmol/L干预12 h;星形胶质细胞:400μmol/L干预3 h）。与过表达空载组相比,LncRNA-AK046375过表达能减轻H2O2所诱发的原代皮层神经元及星形胶质细胞内的氧化应激反应和细胞凋亡;与敲低空载组相比,LncRNA-AK046375敲低能加重H2O2所诱发的原代皮层神经元及星形胶质细胞内的氧化应激反应和细胞凋亡。4.生物信息学技术预测miRNA-491-5p和miRNA-505-3p能够与MT2 mRNA直接结合;双荧光素酶实验证实仅mi R-491-5p能够与MT2mRNA的3’-UTR结合;下调mi R-491-5p的表达,能够减轻H2O2所诱发的原代星形胶质细胞内的氧化应激反应。此外,Ago2-RIP实验及双荧光素酶实验证实LncRNA-AK046375能够与miRNA-491-5p直接结合。结论1.LncRNA-AK046375过表达能减少小鼠TBI后创伤区及周围皮层细胞凋亡,减少神经元的丢失,保持血脑屏障的完整性,改善小鼠TBI后的神经运动功能。2.LncRNA-AK046375通过增加MT2的表达,进而发挥其抗氧化应激作用。3.LncRNA-AK046375通过吸附miRNA-491-5p,减轻miRNA-491-5p对MT2 mRNA的抑制作用,进而使MT2表达增加。