实验目的：　　产生毒副作用是肿瘤药物治疗失败的关键性因素。基于肿瘤组织高表达Legumain和CD44(透明质酸受体)的生物学特性，我们设计、制备了基于透明质酸（hyaluronic acid，HA）的Legumain响应释放阿霉素载体，使阿霉素（Doxorubicin，DOX）在Legumain及CD44高表达的恶性肿瘤组织中聚集、释放，提高药物对肿瘤组织的靶向性，增加药物的治疗效果。药物的靶向运输和缓释是增加药物的治疗效果和减少药物的副作用的一项重要措施，本项目的实施对于探索肿瘤药物靶向治疗新方法具有重要的理论和实践意义。　　实验方法：　　为了实现Legumain响应释放的效果，首先将DOX与Legumain的底物多肽（PEP）化学键合，形成阿霉素-多肽衍生物（DOX-PEP）。用柱层析的方法分离纯化，得到DOX-PEP纯品，并用ESI-MS、NMR等对DOX-PEP进行结构解析。随后将DOX-PEP在EDC/NHS催化下，嫁接到HA的羧基上，并用微乳化法在ADH作用下进一步交联，形成多面体状的HA-PEP-DOX载药纳米粒子。应用马尔文粒度分析仪测定纳米颗粒的粒径、Zeta电位、多分散指数（PDI），并评价纳米颗粒在酸性条件（pH5.0）和中性条件（pH7.0）下的稳定性。使用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察纳米粒子的形貌特征。使用UPLC-MS-MS检测Legumain敏感的纳米药物的体外释放情况。使用双扫描激光共聚焦显微镜观察各细胞对药物的摄取并用流式细胞术定量细胞对药物的摄取。使用CCK-8评价药物的细胞毒性。构建A549人肺癌异种移植瘤模型，将透明质酸包载药物及游离DOX通过尾静脉注入动物体内，定时取血，荧光法测定血清中阿霉素总量（包括释放和未释放），并用UPLC-MS-MS测定释放的药物浓度（DOX-Leu）。以获得该纳米药物在体内的缓释及Legumain响应性质。提取正常组织和肿瘤组织的蛋白质，使用BCA蛋白测定试剂盒对提取的粗蛋白进行 Legumain酶活性评价。用 Cy5.5近红外荧光探针标记HA-PEP-DOX纳米药物，并将其及游离Cy5.5通过尾静脉注入荷瘤小鼠体内，使用小动物活体成像系统在不同时间点观察近红外荧光发射强度（激发光670 nm，发射光710 nm），观察纳米药物的体内分布及肿瘤靶向性。使用酶标仪测定实验组的荷瘤小鼠各组织PBS提取液中DOX的荧光信号（激发光470 nm，发射光590 nm），以定量纳米药物及游离药物的组织分布情况。为了研究纳米药物的体内抗肿瘤功效，将游离DOX、纳米药物及PBS经尾静脉注入荷瘤小鼠体内，首次给药后40天内观察小鼠的肿瘤体积及存活率。将经一段时间药物治疗的荷瘤小鼠的肿瘤组织及心、肝、脾、肾等正常组织取出制成石蜡切片，并对肿瘤组织的切片进行H&E染色，TUNEL细胞凋亡实验及Ki-67免疫组织化学染色，以评价肿瘤组织的组织学变化及细胞凋亡情况。对正常组织的石蜡切片进行H&E染色，TUNEL细胞凋亡实验以评价药物的系统毒性。　　实验结果：　　核磁共振谱图证明阿霉素及其多肽衍生物已成功合成并成功将其接到HA上。纳米粒子粒径约为400 nm，PDI约为0.2。TEM及SEM结果表明，纳米粒子粒径约为300-500 nm，为多面体结构。药物稳定性实验表明，纳米粒子在生理条件（pH7.0）下较稳定，而在酸性条件（pH5.0）下稳定性较差。体外释放结果表明，药物释放受Legumain调控。细胞摄取实验表明，癌细胞（A549， MCF-7和MCF-7/ADR）及正常细胞（L929）对纳米粒子的摄取量均高于对游离DOX的摄取量。并且，癌细胞对纳米粒子的摄取比正常细胞更显著。细胞毒性实验表明，相同药物浓度下，纳米粒子对癌细胞的细胞毒性更显著，对正常细胞的细胞毒性不明显；而游离DOX对癌细胞的细胞毒性不明显，当其作用于正常细胞（L929）时，一半以上的细胞活力被抑制。小鼠血药浓度变化情况表明，载药纳米粒子具有很好的缓释作用。提取的粗蛋白样品的Legumain酶活性评价结果表明，肿瘤组织的Legumain活性显著高于其它组织。用肿瘤组织提取的蛋白与透明质酸包载的药物共培养，结果显示，药物释放显著增加。小动物体内成像结果显示，纳米药物可在肿瘤组织中累积、释放，具有良好的缓释性和肿瘤靶向性。使用酶标仪测定实验组的荷瘤小鼠各组织PBS提取液中DOX的荧光信号，结果表明注射纳米药物的荷瘤小鼠肿瘤组织中DOX的荧光值是游离DOX组的5倍，并且与游离DOX相比，HA-PEP-DOX纳米药物在心脏、肝脏和肾脏中分布很少。纳米药物体内抗肿瘤特性研究结果显示，对照组的肿瘤体积随时间变化快速增加；游离DOX可以抑制肿瘤生长，但对小鼠具有全身毒性，这会影响小鼠的存活率；而我们制备的纳米药物可明显抑制肿瘤生长且毒性较低，具有很高的治疗功效。荷瘤小鼠的心、肝、脾、肾及肿瘤组织切片的H&E染色，TUNEL细胞凋亡实验和Ki-67免疫组织化学染色结果显示，对照组的肿瘤组织生长旺盛；药物治疗组（游离DOX及纳米药物处理组）的肿瘤细胞发生凋亡，其中， HA-PEP-DOX纳米药物治疗组的肿瘤组织尺寸减小，具有最高的细胞凋亡率和坏死率，并且对正常组织的毒性最小。　　实验结论：　　我们设计合成的纳米药物具有将抗肿瘤药物DOX特异性递送至肿瘤组织的能力，具有较高的抗癌活性及较低的系统毒性，为治疗恶性肿瘤提供了新的可能，具有很大的治疗潜力。