一、背景:顺铂（Cis-diaminedichloroplatinum（Ⅱ）,CDDP）是治疗包括卵巢癌、肺癌和宫颈癌等在内的多种实体肿瘤的主要化疗药物之一。在顺铂治疗的过程中,肿瘤细胞最初对顺铂敏感,但在之后逐渐的产生耐受,影响治疗效果。因此寻找肿瘤细胞耐药的治疗靶点一直受到研究者的关注。研究发现,细胞内蛋白质二硫键异构酶（PDI）家族成员之一的PDIA6,主要定位在内质网中,帮助新合成蛋白形成二硫键并处于正确折叠状态,维持内质网内蛋白折叠稳态。在肺癌、卵巢癌、膀胱癌等肿瘤中,PDIA6显示高表达,PDIA6在顺铂耐受的肺腺癌A549细胞中通过调控UPR^er,介导顺铂耐受。在胶质母细胞瘤中敲降PDIA6,影响了 BIP启动子活性,抑制了肿瘤细胞生长和迁移。这些研究提示,PDIA6通过调控UPR^er影响了肿瘤细胞的生存和耐药,探讨PDIA6可能为靶向UPR^er的顺铂治疗途径提供新思路。UPR^mt是在线粒体基质中有未折叠或错误折叠蛋白堆积时,激活的由线粒体向核信号转导介导的保护性转录反应。UPR^mt发生时,线粒体蛋白伴侣（heat shock protein HSP60、HSP10等）表达增加,帮助蛋白质正确折叠,线粒体蛋白酶（ATP-dependent Clp proteolytic subunit 1 ClpP、LONP1 protease 等）表达上调促进未折叠或错误折叠蛋白的清除,以确保线粒体中蛋白折叠稳态。研究报道,HSP60在卵巢癌、膀胱癌等多种肿瘤中表达上调,保护线粒体功能与顺铂耐受呈正相关。LONP1通过稳定293T细胞HSP60和mtHSP70复合体的表达,抑制p53依赖的细胞凋亡,提示UPR^mt的关键蛋白与顺铂耐药密切相关。另有研究报道,PDIA6也定位于线粒体中,Taiji Kimura等研究者第一次报道了 PDIA6分布在牛肝脏细胞的线粒体内,Yu Shitara等研究者在成骨细胞肉瘤细胞的线粒体中也报道有PDIA6的存在,并主要定位在线粒体基质中,在成骨细胞肉瘤细胞的线粒体中过表达PDIA6抑制了 H2O2诱导的细胞死亡。因此认为PDIA6也可能定位在卵巢癌细胞的线粒体中调控了 UPR^mt。并且考虑到PDIA6定位于内质网内调控了 UPR^er,而且UPR^er会影响线粒体内多条信号通路的改变并影响线粒体功能,因此推测UPR^er与UPR^mt之间具有信息交流。研究PDIA6的功能可能有助于探究UPR^er和UPR^mt之间的信息交流在顺铂耐药机制中的作用。在本研究中,我们利用顺铂耐药和非耐药的卵巢癌细胞,探究PDIA6调控UPR^er与UPR^mt的机制。为进一步明确PDIA6在卵巢癌细胞顺铂耐药中的作用,以及以PDIA6为靶向的肿瘤治疗提供新思路。二、方法:以长时间给予顺铂人工诱导产生获得性顺铂耐药的卵巢癌SKOV3/DDP细胞与其亲代人卵巢癌腺癌细胞株SKOV3细胞为研究对象,开展如下研究:1、CCK8检测SKOV3和SKOV3/DDP细胞对于顺铂敏感性之间的差异;DAPI着色细胞核应用荧光显微镜观察顺铂作用下SKOV3和SKOV3/DDP细胞染色质凝聚情况。运用Western Blotting和RT-PCR实验检测SKOV3与SKOV3/DDP细胞内PDIA6蛋白和基因表达的差异。2、运用Annexin V-FITC（+）染色和JC-1检测PDIA6高表达和敲降对顺铂作用下SKOV3与SKOV3/DDP细胞凋亡和线粒体膜电势的影响。Western Blotting实验检测PDIA6高表达和敲降对顺铂作用下SKOV3与SKOV3/DDP细胞凋亡蛋白的影响。3、Western Blotting实验检测顺铂作用下SKOV3与SKOV3/DDP细胞UPR^mt关键蛋白表达差异。选用SKOV3细胞半数致死量6μg/ml的顺铂作用SKOV3与SKOV3/DDP细胞0h、3h、6h、9h、12h和24h,检测UPR^mt关键蛋白表达变化。4、以6μg/ml顺铂作为药物浓度,12h和24h作为用药时间,Western Blotting实验检测PDIA6高表达和敲降对顺铂作用下SKOV3和SKOV3/DDP细胞UPR^mt关键蛋白的影响。5、在SKOV3/DDP细胞中敲降PDIA6,Western Blotting实验检测线粒体分裂、融合相关蛋白表达变化。6、提取SKOV3与SKOV3/DDP细胞的细胞浆和线粒体蛋白,应用Western Blotting检测PDIA6蛋白在线粒体和细胞浆中的表达情况,应用免疫荧光技术检测PDIA6蛋白在线粒体中的定位和表达情况。7、顺铂作用SKOV3和SKOV3/DDP细胞12h和24h,提取细胞浆和线粒体蛋白,应用Western Blotting检测PDIA6蛋白在线粒体和细胞浆中的表达变化。8、Co-IP实验检测线粒体内与PDIA6相互作用蛋白,免疫荧光技术验证其共定位情况。9、Western Blotting实验检测SKOV3与SKOV3/DDP细胞基础水平UPR^er相关蛋白表达差异。选用SKOV3细胞半数致死量6μg/ml顺铂作用SKOV3与SKOV3/DDP细胞0h、3h、6h、9h、12h和24h检测UPR^er相关蛋白表达变化。10、Western Blotting实验检测PDIA6高表达和敲降对顺铂作用下SKOV3与SKOV3/DDP细胞UPR^er关键蛋白的影响。11、使用内质网应激（ERS）诱导剂衣霉素（Tunicamycin,TM）和ERS抑制剂4-苯基丁酸（4-phenylbutyrate,4-PBA）作用 SKOV3 与 SKOV3/DDP 细胞 12h,检测UPR^er与UPR^mt的关系。三、结果:1、SKOV3和SKOV3/DDP细胞在顺铂作用下的半数致死量分别为6μg/ml和20μg/ml。6μg/ml顺铂作用于SKOV3和SKOV3/DDP细胞12h和24h,SKOV3细胞发生染色质凝聚,凋亡小体形成,而SKOV3/DDP细胞未见明显影响。2、PDIA6蛋白在SKOV3/DDP细胞表达明显高于SKOV3细胞,在SKOV3细胞中瞬转高表达PDIA6抑制了顺铂引起的ERS途径和线粒体途径的凋亡。SKOV3/DDP细胞敲降PDIA6基因促进了顺铂引起的卵巢癌细胞ERS途径和线粒体途径的凋亡。3、与SKOV3细胞相比,SKOV3/DDP细胞基础水平的UPR^mt更高。在顺铂作用下,SKOV3细胞UPR^mt反应随作用时间增加而增加,在24h下降;而SKOV3/DDP细胞在顺铂作用下UPR^mt反应强度少量上调,且24h未见下降。4、敲降PDIA6下调了 SKOV3/DDP细胞线粒体折叠蛋白的表达,线粒体蛋白酶表达上调,线粒体分裂和融合蛋白表达下调。高表达PDIA6上调了 SKOV3细胞线粒体折叠蛋白表达,线粒体蛋白酶表达下调。5、PDIA6在SKOV3/DDP细胞线粒体中定位较SKOV3细胞多,并且与线粒体基质蛋白HSP60和LONP1相互作用。6、在顺铂的作用下,PDIA6蛋白在SKOV3细胞的线粒体和细胞浆内蛋白表达均增加。SKOV3/DDP细胞在顺铂的作用下,PDIA6蛋白在线粒体内表达增加,而在细胞浆中表达未见明显变化。7、与SKOV3细胞相比,SKOV3/DDP细胞基础水平的UPR^er更高。在顺铂作用下,SKOV3细胞UPR^er强度随作用时间增加而增加,在24h下降;而SKOV3/DDP细胞在顺铂作用下UPR^er强度未见明显增加。8、敲降PDIA6下调了 UPR^er中PERK下游通路表达,上调了 IRE1 α下游通路表达,对ATF6通路的活化没有影响。9、使用内质网应激诱导剂TM诱导了 UPR^mt,内质网应激抑制剂4-PBA抑制了顺铂引起的SKOV3细胞的UPR^mt。四、结论:1、PDIA6在顺铂耐受的SKOV3/DDP细胞中高表达与顺铂作用下的卵巢癌细胞ERS和线粒体途径的凋亡有关。2、PDIA6定位在卵巢癌细胞的线粒体内与HSP60和LONP1蛋白相互作用调控了UPR^mt。3、PDIA6定位在内质网内调控了顺铂作用下卵巢癌细胞UPR^er。4、PDIA6通过调控UPR^er与UPR^mt诱导了卵巢癌细胞顺铂耐受。