双向转录基因对是指相邻且转录方向相反的两个基因,这种基因组织形式最早是在研究单个基因的生物学功能时发现的。全基因组序列分析表明,双向转录基因对普遍存在于人类、大鼠、小鼠、拟南芥、杨树、水稻和玉米等各类生物基因组中。研究者认为当双向转录基因对的两个转录起始位点之间的距离小于1000 bp时,这段DNA序列可称其为双向启动子。研究表明双向转录基因对存在共表达现象,功能上也有相关性。但是这些研究绝大多数是通过对生物芯片基因表达谱进行数据分析的结果,生物学实验验证的例子并不多,对双向转录基因对的形成机制、共表达几率及功能相关性和双向启动子的调控机制还不甚了解。因为双向转录基因对这种基因组织形式能够使相邻基因共用启动子调控序列,可以在相对有限的DNA序列空间里构建复杂的调控网络,所以受到研究者越来越多地关注,成为基因表达调控研究的新热点。我们通过分析拟南芥基因组DNA序列发现,Atlg71850基因（AtUCH4基因）与Atlg71860基因（AtPTP1基因）在基因组上相邻且转录方向相反,两个基因的转录起始位点之间的距离为347 bp,属于典型的双向转录基因对。对拟南芥基因表达谱数据进行分析发现AtUCH4基因和AtPTP1基因均在吸涨萌发的种子、茎顶端分生组织和幼嫩的花中有较高水平的表达,在成熟花粉和成熟种子中几乎不表达。虽然AtUCH4基因和AtPTP1基因具有非常相似的组织表达模式,但是在响应低温等胁迫时表达情况又相反,呈负相关。总之,通过拟南芥基因表达谱数据分析发现,AtUCH4/AtPTP1双向转录基因对的两个基因表达存在相关性,并在不同的实验条件下表达模式呈现负相关。基于以上的分析结果,本研究进一步分析了启动子序列,搜索控制组织特异性表达和逆境响应有关的调控元件。详细分析了AtUCH4/AtPTP 双向启动子的生物学功能,并鉴定调控两侧基因表达的组织特异性元件和胁迫响应元件,初步阐释了组织特异性元件和逆境胁迫响应元件的调控特性。最后从盐胁迫方面研究AtUCH4基因与AtPTP1基因在盐胁迫响应中的作用,探讨两者在盐胁迫响应途径中的功能相关性。具体的实验结果如下:1AtUCH4/AtPTP1双向基因对的间隔序列是一个有活性的双向启动子通过构建启动子-GUS融合基因,利用GUS组织化学染色和GUS酶活分析的方法证实了 AtUCH4/AtPTP1双向转录基因对的间隔序列确实是一个有活性的双向启动子。但是其转录活性在正反两个方向上是不对称的,在AtPTP1方向的启动活性远高于AtUCH4方向的启动活性。双向启动子两端同时连接报告基因GUS和GFP,通过GUS组织化学染色和GFP活性分析进一步证实了AtUCH4/AtPTP1双向启动子的活性,能够同时驱动两侧两个基因在异源植物烟草中表达。2 AtUCH/AtPTP1双向基因对共表达于相同的组织部位通过分析不同长度的AtPTP1启动子和AtUCH4启动子系列,发现不同长度的AtPTP1启动子只是活性强弱不同,但是组织特异性表达部位是一样的,主要在萌发种子、未成熟花粉粒、茎顶端分生组织、根尖、侧根原基、维管组织中有较高水平的表达。而不同长度的AtUCH4启动子组织特异性表达部位有所改变。全长AtUCH4启动子主要在萌发种子和未成熟花粉粒中表达,在其他部位也有微弱表达。较长的AtUCH4缺失启动子主要在萌发种子、未成熟花粉粒、茎顶端分生组织、根尖、侧根原基和维管组织中表达,与AtPTP1启动子组织特异性表达部位基本一致,并均在萌发种子、茎顶端分生组织和未成熟花粉粒中高水平表达。以上分析可知AtUCH4/AtPTP1双向转录基因对共表达于相同的组织部位。3 AtUCHAtPTP1双向基因对在响应低温和盐胁迫时表达相关分析AtUCH4/AtPTP1双向启动子低温胁迫下的表达变化情况,发现在低温条件下,AtUCH4启动子活性提高,而AtPTP1启动子活性下降,所以AtUCH4/AtPTP1基因对在响应低温胁迫时表达负相关。在盐胁迫下,AtUCH4/AtPTP1双向启动子在两个方向上的表达变化是一致的,内源双向基因对AtUCH4和AtPTP1的表达情况也是一致的,AtUCH4/AtPTP1基因对在响应盐胁迫时表达正相关。4 AtUCH/AtPTP1双向启动子由不同的正负调控元件组成启动子缺失实验分析表明,AtUCH4/AtPTP1双向启动子可以分为三个亚区域:region Ⅰ、region Ⅱ和region Ⅲ。双向启动子的基础转录活性在AtPTP1方向上由一个强的正调控区（region Ⅰ）和一个弱的负调控区（region Ⅱ）控制,在AtUCH4方向上由一个弱的正调控区（region Ⅱ）和一个弱的负调控区（region Ⅲ）控制。初步分析发现site Ⅱ元件和telo-box元件共同调控AtPTP1启动子活性,而AtUCH4启动子活性主要依赖于site Ⅱ元件和ACGT基序。双向启动子的冷诱导表达活性在AtPTP1方向上由region Ⅱ负调控区控制,在AtUCH4方向上由region Ⅱ正调控区和region Ⅲ负调控区控制。进一步分析发现region Ⅱ中的as-1/ocs-like元件是一个冷响应元件。在低温胁迫下,as-1/ocs-like元件的作用具有方向依赖性,正向时下调而反向时上调基因的表达水平,是一个方向敏感性低温响应元件。5AtUCH4/AtPTP1双向基因对参与盐胁迫响应uuch4突变体和ptp1突变体在100 mM和150 mMNaCl盐浓度下的种子萌发情况显示uch4突变体和ptp1突变体的萌发率明显低于野生型的萌发率。表明uch4突变体和ptp1突变体在种子萌发阶段对NaCl胁迫比野生型敏感。对uch4突变体功能回复株系、ptp1突变体功能回复株系和野生型进行100 mM和150 mM NaCl盐浓度下的种子萌发率测定实验。结果表明,uch4突变体功能回复株系、ptp1突变体功能回复株系和野生型的萌发率没有明显差异。实验结果表明uch4突变体和ptp1突变体在盐处理后的种子萌发表型差异确实是由于AtUCH4基因和AtPTP1基因功能缺失分别引起的,AtUCH4/AtPTP1双向基因对在盐胁迫响应过程中起作用。以上研究为筛选获得具有转基因应用价值的双向启动子提供理论指导,为揭示双向转录基因对的共转录调控机制、共表达几率和功能相关性提供了重要的实验依据,对理解双向基因对这种基因结构形式具有重要的理论意义。