【摘 要】
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DMRT1是一种在哺乳动物睾丸生殖细胞和其支持细胞中表达，对哺乳动物睾丸发育起关键作用的一种转录因子。Sox2是一种干性转录因子，在维持小鼠胚胎干细胞的多能性和自我更新过程中起关键作用。为了阐明DMRT1对Sox2的调控作用，本研究以小鼠F9细胞系为模型，利用实时定量PCR（Real timePCR）、双荧光素酶报告基因分析（Dual-Luciferase Reporter assay）等方法，从
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DMRT1是一种在哺乳动物睾丸生殖细胞和其支持细胞中表达，对哺乳动物睾丸发育起关键作用的一种转录因子。Sox2是一种干性转录因子，在维持小鼠胚胎干细胞的多能性和自我更新过程中起关键作用。为了阐明DMRT1对Sox2的调控作用，本研究以小鼠F9细胞系为模型，利用实时定量PCR（Real timePCR）、双荧光素酶报告基因分析（Dual-Luciferase Reporter assay）等方法，从不同角度研究了DMRT1对Sox2的影响。实验结果如下：构建了DMRT1过表达载体pCMV-DMRT1；干扰载体pSuper-sh454、pSuper-sh737、pSuper-sh1098、干扰对照载体pSuper-shc；从小鼠基因组上扩增得到Sox2转录起始位点上游3Kb的启动子区域，并根据实验目的设计引物进行截短，克隆到萤火虫荧光素酶报告载体pGL4.10中，得到不同长度的Sox2启动子报告载体pGL-Sox2-3K、pGL-Sox2-1.6K、pGL-Sox2-1.5K、pGL-Sox2-JD1、pGL-Sox2-JD2、pGL-Sox2-JD3。分别对过表达载体、干扰载体、启动子活性报告载体进行验证，结果表明各载体序列正确，在小鼠F9细胞系中均能发挥功能达到预期效果。在小鼠F9细胞系中过表达DMRT1，通过realtime PCR技术检验內源Sox2、Nanog、Oct4、Klf4的表达量，结果表明过表达DMRT1后Sox2的表达量产生显著性下降，而Nanog、Oct4、Klf4的表达量无明显变化；但是干扰DMRT1时所有四种干性转录因子的表达水平均未产生显著性变化。本实验旨在研究DMRT1对Sox2的调控作用，设计进一步研究DMRT1是否与Sox2启动子之间存在相互作用。向小鼠F9细胞系中共转染过表达载体DMRT1、含Sox2启动子区的萤火虫荧光素酶报告载体，对不同长度的Sox2启动子活性进行双荧光素酶报告检测，结果表明：与对照组相比过表达DMRT1对各个不同长度的Sox2启动子均有激活着用，但报告载体pGL-Sox2-3K、pGL-Sox2-1.6K、pGL-Sox2-1.5K对比pGL-Sox2-JD1、pGL-Sox2-JD2、pGL-Sox2-JD3，激活作用有明显的提升，这暗示着Sox2启动子区的JD1和1.5K之间可能存在着一个对应反式作用因子DMRT1的一个顺式作用元件。为了进一步验证该顺式作用元件的特异性,过表达Brsk2基因，对报告载体pGL-Sox2-1.6K、pGL-Sox2-1.5K、pGL-Sox2-JD1的启动子活性进行检验，结果表明：与对照组相比，过表达Brsk2对启动子活性没有影响，并且Sox2启动子区的JD1和1.5K之间可能的顺式作用元件没有对Brsk2产生响应，三个载体之间没有明显的活性差异。
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