非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)是非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty live diseases,NAFLD)最严重的形式,也是一种进行性的纤维化病,25％NASH患者可发展为肝硬化,NASH相关的肝硬化可以发展成亚急性肝衰竭、肝细胞癌、移植后再移植。肝活检仍旧是NASH诊断的金指标。为了制备其相应的试剂盒,提高NASH的诊断率,进行了以下实验研究。 首先,为了试剂盒的制备,每一个基因分两段设计引物来制备抗原,进而制备相应的抗体,分别作为捕获抗体和酶标抗体；同时用基因工程的方法分别用两个表达载体构建了20种蛋白的40个融合表达载体,并在大肠杆菌中进行表达,不同的载体蛋白带有不同的标签,分别用来免疫动物及筛选抗体,解决了单抗筛选中抗标签抗体的干扰；即以成人肝cDNA表达文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Ag和PET-32a-Ag。GST-Ag融合蛋白在大肠杆菌中表达,被作为免疫原制备兔抗血清和鼠单抗。采用ELISA法和Western blot鉴定抗血清在重组蛋白和天然蛋白中的特异性。采用蛋白印迹,间接免疫荧光,免疫组化鉴定单抗的特异性。 综上所述,本研究共表达了40种融合蛋白并成功制备出兔抗血清和10株鼠单克隆抗体。Western blot鉴定表明,制备的兔多克隆抗体可特异地识别成人肝总蛋白中相应蛋白。获得2种可稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株可识别重组人NASH相关基因蛋白,并可特异性结合HepG2细胞质中的相应蛋白和成人肝细胞质中的相应蛋白。