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乳腺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,已经对女性的生命健康构成了严重的威胁,其有效的治疗药物研发仍是研究的热点问题。自噬是一种可以维持稳态并且高度保守的途径,在肿瘤发生发展进程中起着重要的作用。当处于不同的环境时,自噬可能分别具有细胞保护作用、细胞毒性作用、非细胞保护作用或者细胞抑制作用等。小分子药物JK184是一种强效的Hedgehog基因(Hh)抑制剂,在本研究中,我们发现经过JK184干预可导致乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的死亡,该死亡表现出药物的剂量依赖性且伴随着细胞自噬的发生。进一步研究表明,在本实验条件下自噬的抑制促进了 JK184的肿瘤抑制作用。其可能机制为,JK184通过抑制Akt/mTOR通路,诱导乳腺癌细胞自噬,同时提示JK184与自噬抑制剂联合使用可能成为临床乳腺癌的潜在治疗策略。目的:为研究小分子药物JK184对乳腺癌细胞的抑制作用及可能的机制,以不同的人乳腺癌细胞系为研究对象,探讨:(1)JK184是否可以抑制乳腺癌细胞的生长和增殖;(2)JK184作用于乳腺癌细胞的同时对细胞自噬的影响及可能的机制。方法:分别在乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549和SKBR3,以及正常乳腺上皮细胞系MCF-10中开展以下研究:(1)探讨JK184是否可以抑制乳腺癌细胞的生长增殖:①分别用不同浓度的JK184(lnM、2 nM、4 nM、6 nM、8 nM)处理 MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、SKBR3 和 MCF-10 细胞 24h,行活细胞计数观察。②采用EdU细胞增殖试剂盒检测MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖情况,结果采用高内涵成像系统观测后通过Image J软件对活细胞数量进行分板。③分别用不同浓度JK184(1nM、2nM、4nM、8nM)处理MCF-7和MDA-MB-231细胞24h,通过细胞克隆形成实验对此条件下的细胞生长增殖情况进行检测,再采用Image J软件对活细胞数量进行分析。④分别用不同浓度JK184(4 nM、8 nM)处理MCF-7和MDA-MB-231细胞24h,通过共聚焦激光扫描显微镜进行拍摄,再采用Image J软件对活细胞数量进行分析。(2)研究JK184作用于乳腺癌细胞的同时对自噬的影响:①不同浓度JK184处理MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549 和 SKBR3 细胞24h,采用Western blot分别检测MCF-7和MDA-MB-231细胞自噬微管相关蛋白轻链 3(Microtubule-associated proteinslA/1B light chain 3,LC3)、Beclinl、自噬相关蛋白-5(Autophagyprotein 5,ATG5)和蛋白 Sequestosome 1(p62/SQSTM1)以及 MDA-MB-468、BT549和SKBR3细胞自噬相关蛋白LC3、P62的表达情况。②溶酶体处于酸性环境,因此,自噬体与溶酶体融合过程中会出现酸性囊泡细胞器(Acidic vesicular organelles,AVO)。JK184 处理 MCF-7 和MDA-MB-231细胞24h,使用吖啶橙(Sigma-Aldrich)检测自噬标志AVO。③JK184处理24h,用免疫荧光技术对MCF-7和MDA-MB-231中的自噬标记物LC3斑点形成情况进行分析。(3)探讨JK184作用下乳腺癌细胞的自噬流是否通畅:①在MDA-MB-231以及MCF-7中转染串联mRFP-GFP标记的LC3质粒,再采用JK184和自噬溶酶体抑制剂(Chloroquine,CQ)联合处理转染后的细胞24h,通过免疫荧光检测外源性LC3斑点表达量。②JK184与CQ联合处理MDA-MB-231、MCF-7细胞24h,通过免疫荧光技术来检测内源性LC3斑点的情况。③使用western blot技术验证选择性PI3K抑制剂3-甲基腺嘌吟(3-Methyladenine,3-MA)与 CQ 和 JK184 联合处理 MDA-MB-231、MCF-7细胞24h后LC3的表达量。(4)分析JK184对乳腺癌细胞的生长抑制作用与其它细胞死亡方式的相关性:JK184分别与凋亡抑制剂Z-VAD-FMK以及铁死亡抑制剂ferrostatin-1联合处理MDA-MB-231和MCF-7细胞24h,对活细胞进行计数分析。(5)探讨JK184作用于乳腺癌细胞时自噬发挥的作用:①分别将JK184与3-MA、CQ联合处理MDA-MB-231和MCF-7细胞24h,采用活细胞计数方法统计分析。②分别构建自噬相关蛋白ATG5、Beclin1的敲降质粒,转染MDA-MB-231和MCF-7后用western blot技术检测ATG5、Beclin1的表达,以此评判转染是否成功。③分别用不同浓度JK184(2 nM、4 nM、6 nM)处理转染成功的 MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞24h,进行活细胞计数。④JK184处理转染成功的MDA-MB-231和MCF-7细胞24h,采用细胞克隆形成技术对活细胞进行分析后通过Image J软件对细胞数量进行计数。(6)探讨JK184处理乳腺癌细胞后对自噬信号通路的影响:不同浓度JK184(1nM、2 nM、4 nM)处理MDA-MB-231和MCF-7细胞24h,采用western blot技术检测Akt/mTOR通路相关蛋白Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、核糖体 S6 激酶(Ribosome S6 protein kinase,p70S6K)和真核生物启动因子4E结合蛋白1(Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,4EBP1)以及磷酸化Akt、mTOR、P70S6K和4EBP1的表达水平。结果:(1)活细胞计数实验显示:JK184呈浓度依赖性在体外抑制MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549和SKBR3细胞的生长,同时EdU增殖检测、细胞克隆形成和共聚焦激光扫描显微镜拍摄均证实JK184可以有效抑制MCF-7和MDA-MB-231的生长增殖,差异具有显著性(P值<0.001)。(2)western blot 实验表明,经JK184处理后,MCF-7和MDA-MB-231中细胞自噬相关蛋白LC3、Beclin1和ATG5表达上调,P62蛋白表达下调;MDA-MB-468、BT549和SKBR3中自噬相关蛋白LC3、P62表达分别有上调和下调,提示JK184可诱导上述乳腺癌细胞的自噬。吖啶橙处理后AVO增加以及免疫荧光实验证实LC3表达量的上调,差异具有显著性(P值<0.001),均证实经JK184处理后的 MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549 和 SKBR3细胞自噬被诱导。(3)JK184与CQ联合处理转染外源性LC3质粒的MCF-7 和 MDA-MB-231以及未经转染的 MCF-7 和 MDA-MJB-231细胞,免疫荧光结果显示JK184+CQ组无论是外源性还是内源性LC3斑点均明显多于仅使用JK184处理的对照组,差异具有显著性(P值<0.001)。同时,western blot 结果也证明 JK184+CQ 组与 JK184 组相比LC3表达量上调,JK184+3-MA与JK184组相比LC3表达量下调,说明在阻断自噬前期PI3K合成后,下游的LC3表达下调,而在阻断自噬后期自噬溶酶体形成后,上游的LC3表达上调,上述结果表明,在JK184作用的乳腺癌细胞中自噬流通畅。(4)通过活细胞计数实验结果表明,经JK184处理后的MCF-7和MDA-MB-231细胞中凋亡和铁死亡这两种程序性死亡方式没有发生明显变化,差异无统计学意义(P值>0.05),提示JK184导致的乳腺癌细胞死亡不涉及这两种死亡途径。(5)JK184分别与CQ和3-MA联合处理MCF-7以及MDA-MB-231细胞后,通过细胞计数可以发现活细胞数目明显减少,差异具有显著性(P值<0.01),说明JK184与自噬抑制剂联合使用可以促进MCF-7和MDA-MB-231细胞死亡,进而提示这种实验条件下的自噬对乳腺癌细胞具有保护作用。通过活细胞计数与细胞克隆形成实验发现,JK184处理ATG5与Beclin1被敲降的MCF-7和MDA-MB-231细胞后,活细胞数量明显减少(P值<0.01),差异具有显著性,这从另一个角度证实了上述假设,即JK184作用于MCF-7和MDA-MB-231时自噬发挥了细胞保护作用,阻断自噬可以增强JK184在乳腺癌细胞中的肿瘤抑制作用。(6)JK184处理MCF-7和MDA-MB-231后,磷酸化Akt、mTOR、p70S6K和4EBP1蛋白表达均下调,提示JK184处理MCF-7和MDA-MB-231的过程中通过抑制Akt/mTOR通路来诱导癌细胞的白噬。结论:(1)JK184可以时间和剂量依赖的方式抑制乳腺癌细胞生长增殖,同时诱导细胞产生保护性自噬;(2)JK184通过抑制Akt/mTOR通路诱导细胞保护性自噬;(3)抑制JK184诱导的保护性自噬可以增强JK184的肿瘤抑制作用。