论文部分内容阅读
【目的】
1.在动物水平评估抑制SIRT2去乙酰化活性对于AD小鼠模型的认知能力和AD小鼠模型相关病理的影响。
2.探讨SIRT2干预挽救AD的可能机制，为AD预防和治疗提供新靶点以及可靠的理论依据。
【方法】
1.动物水平上评估SIRT2去乙酰化活性能否影响AD的病程发展
总共30只小鼠，分别为10只10月龄雄性野生型小鼠，20只10月龄雄性APP/PS1转基因小鼠。共分为三组小鼠，分别是C57对照小鼠，APP/PS1小鼠，AK-7+APP/PS1小鼠，每组10只，每天分别腹腔注射10%DMSO的生理盐水，10%DMSO的生理盐水，10%DMSO的生理盐水AK-7(SIRT2去乙酰化酶抑制剂)，100MG/KG，一天两次，持续注射3周。这三组小鼠注射完之后立即进行行为学实验，检测其SIRT2活性被抑制后有无认知变化。进行完行为学检测分别进行心脏灌注取下小鼠的一半海马与皮质，称量其海马与皮质的重量，以1UG/UL的RIPA进行溶解。将其溶解样品进行BCA法配平，进行蛋白质印迹分析与ELISA检测。另一半脑进行冰冻保存，做冰冻切片免疫荧光检测Aβ的含量情况。
2.探寻SIRT2影响BACE1分子机制
本实验室中保存的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞在DMEM中培养。SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞经胰酶消化，铺板于6个孔板(3-5分钟胰酶消化细胞，以2ML/孔接种)，培养24小时直到达到75％的汇合度，然后与最佳数量的质粒结合。然后将含病毒的培养基取出并用新鲜培养基代替。SIRT2过表达(SIRT2过表达)细胞在DMEM中培养补充10％FBS和100U/ML青霉素-链霉素。所有将细胞在37℃下于5％CO2的潮湿培养箱中培养。在荧光显微镜下观察细胞和Westernblot分析证实转染效率。取得的SIRT2过表达SH-SY5Y细胞样品进行免疫共沉淀实验，获得的混合蛋白样品送至公司进行质谱分析，生信分析与神经退行性疾病相关蛋白，筛查SIRT2在神经细胞中的互做蛋白。再通过前期Itarq定量蛋白质方法获得的APP/PS1年轻与老龄小鼠海马区表达的差异蛋白做比对，在这两个区间找的合集筛选出互做蛋白。随后初步探寻筛选得到的候选蛋白在AD动物模型的表达差异。60只雄性APP/PS1小鼠分别为10月龄组，15月龄组，20月龄组。每组20只。60只雄性野生型小鼠分别为10月龄，15月龄，20月龄。每组20只。分为三组，分别取下小鼠的海马与皮质，称量其海马与皮质的重量，以1ug/uL的RIPA进行溶解，将其溶解样品进行BCA法配平，进行蛋白质印迹分析筛选出的SIRT2互做蛋白的含量情况。
【结果】
1.C57对照小鼠，APP/PS1小鼠，AK-7+APP/PS1小鼠三组小鼠进行Morris水迷宫实验。结果显示在通过平台次数、第三象限时间/总时间、第三象限路程/总路程三个检测项目中APP/PS1+AK-7小鼠优于APP/PS1小鼠(P＜0.05)。
2.C57对照小鼠，APP/PS1小鼠，AK-7+APP/PS1小鼠三组小鼠进行行为学实验后心脏灌注取下小鼠的一半海马与皮质，进行WesternBloting(WB)与ELISA检测。结果显示，说明SIRT2去乙酰化活性抑制通过调控BACE1蛋白水平最终缓解了Aβ的沉积。
3.SIRT2过表达的SH-SY5Y细胞样品进行IP，获得的混合蛋白样品进行质谱分析，再通过Itarq定量蛋白质组方法确定APP/PS1老龄小鼠表达差异蛋白，最终发现RTN4B在与SIRT2有潜在相互作用，并RTN4B与BACE1有潜在相互作用，可能是SIRT2调控BACE1的关键介导蛋白。
4.进一步比较不同月龄(10,20月龄)APP/PS1小鼠海马区和皮质的SIRT2蛋白水平，结果发现差异无显著性。进一步检测APP/PS1小鼠海马和皮质中10月龄和20月龄RT4N4B的蛋白水平，发现RTN4B在不同年龄阶段的海马区其蛋白水平均低于正常小鼠(P＜0.05)。
【结论】
1.抑制SIRT2去乙酰化活性改善AD小鼠模型的认知障碍。
2.抑制SIRT2去乙酰化活性降低了AD小鼠模型海马区BACE1蛋白水平并影响了Aβ的水平。
3.SIRT2对于BACE1的调控作用可能是通过RTN4B介导的。
1.在动物水平评估抑制SIRT2去乙酰化活性对于AD小鼠模型的认知能力和AD小鼠模型相关病理的影响。
2.探讨SIRT2干预挽救AD的可能机制，为AD预防和治疗提供新靶点以及可靠的理论依据。
【方法】
1.动物水平上评估SIRT2去乙酰化活性能否影响AD的病程发展
总共30只小鼠，分别为10只10月龄雄性野生型小鼠，20只10月龄雄性APP/PS1转基因小鼠。共分为三组小鼠，分别是C57对照小鼠，APP/PS1小鼠，AK-7+APP/PS1小鼠，每组10只，每天分别腹腔注射10%DMSO的生理盐水，10%DMSO的生理盐水，10%DMSO的生理盐水AK-7(SIRT2去乙酰化酶抑制剂)，100MG/KG，一天两次，持续注射3周。这三组小鼠注射完之后立即进行行为学实验，检测其SIRT2活性被抑制后有无认知变化。进行完行为学检测分别进行心脏灌注取下小鼠的一半海马与皮质，称量其海马与皮质的重量，以1UG/UL的RIPA进行溶解。将其溶解样品进行BCA法配平，进行蛋白质印迹分析与ELISA检测。另一半脑进行冰冻保存，做冰冻切片免疫荧光检测Aβ的含量情况。
2.探寻SIRT2影响BACE1分子机制
本实验室中保存的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞在DMEM中培养。SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞经胰酶消化，铺板于6个孔板(3-5分钟胰酶消化细胞，以2ML/孔接种)，培养24小时直到达到75％的汇合度，然后与最佳数量的质粒结合。然后将含病毒的培养基取出并用新鲜培养基代替。SIRT2过表达(SIRT2过表达)细胞在DMEM中培养补充10％FBS和100U/ML青霉素-链霉素。所有将细胞在37℃下于5％CO2的潮湿培养箱中培养。在荧光显微镜下观察细胞和Westernblot分析证实转染效率。取得的SIRT2过表达SH-SY5Y细胞样品进行免疫共沉淀实验，获得的混合蛋白样品送至公司进行质谱分析，生信分析与神经退行性疾病相关蛋白，筛查SIRT2在神经细胞中的互做蛋白。再通过前期Itarq定量蛋白质方法获得的APP/PS1年轻与老龄小鼠海马区表达的差异蛋白做比对，在这两个区间找的合集筛选出互做蛋白。随后初步探寻筛选得到的候选蛋白在AD动物模型的表达差异。60只雄性APP/PS1小鼠分别为10月龄组，15月龄组，20月龄组。每组20只。60只雄性野生型小鼠分别为10月龄，15月龄，20月龄。每组20只。分为三组，分别取下小鼠的海马与皮质，称量其海马与皮质的重量，以1ug/uL的RIPA进行溶解，将其溶解样品进行BCA法配平，进行蛋白质印迹分析筛选出的SIRT2互做蛋白的含量情况。
【结果】
1.C57对照小鼠，APP/PS1小鼠，AK-7+APP/PS1小鼠三组小鼠进行Morris水迷宫实验。结果显示在通过平台次数、第三象限时间/总时间、第三象限路程/总路程三个检测项目中APP/PS1+AK-7小鼠优于APP/PS1小鼠(P＜0.05)。
2.C57对照小鼠，APP/PS1小鼠，AK-7+APP/PS1小鼠三组小鼠进行行为学实验后心脏灌注取下小鼠的一半海马与皮质，进行WesternBloting(WB)与ELISA检测。结果显示，说明SIRT2去乙酰化活性抑制通过调控BACE1蛋白水平最终缓解了Aβ的沉积。
3.SIRT2过表达的SH-SY5Y细胞样品进行IP，获得的混合蛋白样品进行质谱分析，再通过Itarq定量蛋白质组方法确定APP/PS1老龄小鼠表达差异蛋白，最终发现RTN4B在与SIRT2有潜在相互作用，并RTN4B与BACE1有潜在相互作用，可能是SIRT2调控BACE1的关键介导蛋白。
4.进一步比较不同月龄(10,20月龄)APP/PS1小鼠海马区和皮质的SIRT2蛋白水平，结果发现差异无显著性。进一步检测APP/PS1小鼠海马和皮质中10月龄和20月龄RT4N4B的蛋白水平，发现RTN4B在不同年龄阶段的海马区其蛋白水平均低于正常小鼠(P＜0.05)。
【结论】
1.抑制SIRT2去乙酰化活性改善AD小鼠模型的认知障碍。
2.抑制SIRT2去乙酰化活性降低了AD小鼠模型海马区BACE1蛋白水平并影响了Aβ的水平。
3.SIRT2对于BACE1的调控作用可能是通过RTN4B介导的。