前列腺癌是一种高发病率和死亡率的疾病,严重影响着全球性男性的健康。治疗手段主要有手术,放射治疗,化疗,冷冻手术,荷尔蒙治疗等。其中,化疗主要针对手术和放射治疗后复发,或者不能进行手术和放疗的病人。但高危和耐药的病例治疗效果却难以令人满意,且化疗药物的毒副作用也影响了治疗效果。因此,能找到一种特定靶位的高效、低毒、特异性强的新型抗肿瘤药尤为重要。乌贼墨在《本草拾遗》中有“腹中墨,主治血公民心痛”的记载,对功能性子宫出血、肺结核咯血等出血性疾病有止血作用。日本学者发现乌贼墨具有高效抗肿瘤活性作用,对肿瘤的抑制率达到64%。而国内研究大多用乌贼墨匀浆进行抗肿瘤活性作用研究。本实验用酶解的方法进行乌贼墨寡肽提取,并将其作用于体外培养的前列腺癌细胞,借助细胞生物学和分子生物学手段,研究乌贼墨寡肽对DU-145、PC-3和H1299细胞的增殖影响及作用机理,为开发乌贼墨寡肽作为抗肿瘤新药研究打下扎实的基础。材料和方法本研究以新鲜的乌贼墨为原料,通过胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶酶解获得乌贼墨酶解物并以氨基态氮含量的大小来筛选酶种,并优化其酶解条件。将酶解液用超滤、G-25分子筛凝胶层析进行分离纯化,并进行抗癌活性筛选,收集抗癌活性最高峰。然后将收集的峰进行进一步分离纯化,并用高效液相进行纯度检测。分离纯化得到的寡肽进行氨基酸序列检测。以体外培养的DU-145、PC-3和H1299细胞为研究对象,将提取所得的寡肽以不同的药物浓度用24h,从6个方面探讨乌贼墨寡肽对DU-145、PC-3和H1299细胞细胞生物学行为的影响及其机理。1、CCK-8法测定细胞增殖抑制率与药物浓度、作用时间的关系。2、倒置显微镜和HE染色观察寡肽作用前后DU-145、PC-3和H1299细胞生长情况和形态变化。3、AO/EB染色方法检测寡肽作用前后DU-145、PC-3和H1299细胞凋亡情况。4、流式细胞仪检测寡肽作用前后DU-145、PC-3和H1299细胞的早期凋亡率。5、免疫组化方法检测寡肽作用前后DU-145、PC-3和H1299细胞中Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白阳性表达情况。6、原位杂交方法检测寡肽作用前后DU-145和PC-3细胞中p53mRNA和BRCA1mRNA表达的变化。研究结果1、乌贼墨寡肽的N端氨基酸序列为:此处保密,分子量为此处保密Da。2、CCK-8法结果显示,不同浓度的乌贼墨寡肽对DU-145、PC-3和H1299细胞均有增殖抑制作用,呈剂量和时间依赖(P<0.05)。3、加入一定浓度的乌贼墨寡肽24 h后,细胞出现生长抑制的现象,细胞周围伸出较多突起;或体积缩小,间隙增宽,胞质内有空泡,深色颗粒显著增多;部分细胞死亡,漂浮于培养液中。HE染色后,可见细胞形态不规则,细胞质出现空泡,核仁数目减少,细胞轮廓模糊,巨核细胞增多,染色质凝聚、核固缩等凋亡的形态学改变。4、AO/EB双染在荧光显微镜下观察,对照组无明显凋亡细胞,5mg/mL乌贼墨寡肽组开始出现早期凋亡细胞,10 mg/mL、15 mg/mL乌贼墨寡肽组晚期凋亡细胞逐渐增多,核浓聚、偏位、被染成桔红色,可见明显的凋亡小体。5、应用Annexin V-FITC/ PI双标记流式细胞术检测后发现,DU-145、PC-3和H1299细胞经乌贼墨寡肽作用后,早期凋亡细胞随着作用时间和药物浓度的增加而增加。5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL乌贼墨寡肽作用24h后DU-145早期凋亡率分别为11.84%、29.22%和38.26%,PC-3早期凋亡率分别为22.76%、34.08%和39.96%,H1299早期凋亡率分别为12.64%、43.82%和31.78%,明显高于对照组(P<0.05)。6、乌贼墨寡肽作用DU-145、PC-3和H1299细胞后,三种细胞中Bcl-2蛋白随着作用浓度的增加,阳性表达减弱。三种细胞中Caspase-3和Caspase-9随着作用浓度的增加,阳性表达增加。7、乌贼墨寡肽以10mg/mL作用于DU-145和PC-3细胞24h后,两种细胞中p53mRNA与对照组相比,表达量增加;两种细胞中BRCA1mRNA表达量增加。研究结论1、乌贼墨寡肽对DU-145、PC-3和H1299细胞有明显的增殖抑制作用,呈剂量和时间依赖。2、乌贼墨寡肽对DU-145、PC-3和H1299细胞的抑制作用机制是诱导细胞凋亡。3、乌贼墨寡肽诱导DU-145、PC-3和H1299细胞凋亡的机理是通过上调Caspase-3和Caspase-9蛋白表达,p53和BRCA1mRNA表达;下调Bcl-2蛋白表达。