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第一部分siRNA沉默PSMD1基因对骨髓增生异常综合征细胞系SKM-1生物学特性的影响目的:我们课题组采用巢式病例对照研究,首次建立了我国435例成人初发、未治的骨髓增生异常综合征(MDS)患者的研究队列,并对其随访。至随访终点,383例(88%)患者得到随访,52例(12%)患者失访。共有41例患者转化为急性白血病(病例组),358例患者未转化为急性白血病(对照组)。从病例组挑选3例患者,将起病时和转白时的骨髓标本进行人全基因组表达芯片检测,完成自身对照研究。按照1:1配比,从病例组和对照组中各挑选满足配对条件的3例患者的起病时骨髓标本进行全基因表达谱芯片检测,完成病例对照研究。最终筛选出由6条基因组成的子集,可以将病例组和对照组明显、稳健地区别开。这6条基因按差异程度依次为TUBB、PSMD1、SLC7A5、ATG3、TUBB2C和TIMM10。其中,差异最大的为TUBB基因,课题组成员已完成对它的研究,所以我们选取了差异仅次于TUBB基因的PSMD1基因进行下一步研究。本研究应用siRNA技术对PSMD1基因进行沉默,观察SMD1基因沉默前后MDS SKM-1细胞系生物学特性的变化,初步探讨PSMD1基因可能在MDS向白血病转变(转白)过程中的作用。方法:采用阳离子脂质体转染方法,在MDS转白细胞系SKM-1中导入化学合成的PSMD1特异性siRNA。转染24小时后收集细胞,测定转染效率。使用Realtime PCR方法检测转染组和对照组细胞中PSMD1基因水平的表达情况。观察、比较PSMD1基因沉默前后SKM-1细胞系的生长曲线、细胞周期、细胞凋亡的变化,以及对nod/scid小鼠模型的影响。结果:转染PSMD1特异性siRNA后24小时,Realtime PCR检测结果显示:转染组PSMD1基因的mRNA表达水平较未转染组显著下降(P<0.05)。转染组PSMD1特异性siRNA沉默PSMD1基因后,SKM-1细胞系的增殖受到抑制(P<0.05)。与阴性对照组相比,转染PSMD1特异性siRNA沉默PSMD1基因后,SKM-1细胞系的G2期细胞比例下降,而S期细胞比例上升,提示PSMD1-siRNA主要作用于S/G2限制点,从而将SKM-1细胞周期阻滞在S/G2。细胞凋亡结果显示,转染PSMD1特异性siRNA沉默PSMD1基因后,SKM-1细胞与阴性对照组SKM-1细胞相比,早期凋亡(24.7%Vs3.5%)与晚期凋亡(5.6%Vs0.6%)的细胞比例均明显上升(P<0.05)。对PSMD1-siRNA转染组和阴性对照组的nod/scid小鼠观察15天,结果显示:两组小鼠生长状态良好,尚未出现明显的纳差、消瘦、萎靡少动、毛色晦暗、松散等与MDS/AML相关的症状,可能与模型的建立时间尚短有关,还需对小鼠继续观察。结论:转染PSMD1特异性siRNA,沉默PSMD1基因后,SKM-1细胞系的增殖能力发生抑制,细胞周期被阻滞在S/G2期,细胞凋亡数量也明显增多。nod/scid小鼠实验结果显示,PSMD1-siRNA转染组的小鼠与阴性对照组相比,成瘤率、存活率未见明显区别。提示SKM-1细胞沉默PSMD1基因后肿瘤生物学行为有所改变,恶性程度有所降低,但对nod/scid小鼠模型的影响尚不明确,仍需继续观察;PSMD1基因可能通过影响MDS的泛素蛋白酶体系统在MDS转白过程中起作用。第二部分增强ATG3基因表达对骨髓增生异常综合征细胞系SKM-1生物学特性的影响目的:我们已经通过巢式病例对照研究和全基因组表达谱芯片分析,筛选出了6条基因组成的子集,可以将病例组和对照组稳健区分。其中,5条差异基因为上调基因,仅ATG3为下调的差异基因。本研究应用慢病毒技术,提高SKM-1细胞系中ATG3基因的表达,观察ATG3基因过表达前后MDS细胞系生物学特性的变化,初步探讨ATG3基因可能在MDS转白过程中的作用。方法:构建带有ATG3基因的慢病毒载体,通过慢病毒感染SKM-1细胞系,提高SKM-1细胞系中ATG3基因的表达。使用western blot从蛋白水平检测ATG3表达情况。使用Realtime PCR检测病毒滴度。表达观察和比较ATG3基因过表达前后MDS转白细胞系在细胞活力、生长曲线、细胞凋亡、nod/scid小鼠模型等生物学特性的改变。结果:构建慢病毒后,测序结果显示与目标序列一致,western blot检测质粒表达情况,结果显示条带与目的基因融合蛋白吻合,质粒构建成功。运用RealtimePCR检测病毒滴度为2×108TU/ml。将带有(?)TG3基因的过表达慢病毒感染细胞72小时后,细胞生长曲线(CCK-8法)结果显示:与阴性对照组相比,慢病毒感染组的细胞生长明显受到抑制(P<0.05)。台盼蓝染色显示,ATG3过表达慢病毒感染后的细胞活力为65%,阴性对照组的细胞活力为79%(P<0.05)。ATG3慢病毒过表达组的细胞与阴性对照的SKM-1细胞相比,早期凋亡(19.4%Vs47.7%)的细胞比例下降,而晚期凋亡和死亡(34.2Vs14.1%)的细胞比例明显上升。对ATG3过表达组和阴性对照组的nod/scid小鼠观察15天,两组小鼠均未出现明显的弓背、消瘦、萎靡少动、毛色晦暗、松散等与MDS/AML相关的症状,可能与模型的建立时间尚短有关,还需对小鼠继续观察。结论:将过表达ATG3基因的慢病毒载体感染SKM-1细胞系后,SKM-1细胞的生物学特性发生改变。ATG3过表达慢病毒感染后的SKM-1细胞死亡比例高于阴性对照组。ATG3过表达慢病毒感染SKM-1细胞系后,SKM-1细胞系的增殖能力受到抑制。ATG3慢病毒过表达ATG3基因后有促使SKM-1细胞从早期凋亡进入晚期调亡和死亡的作用。但ATG3过表达对nod/scid小鼠模型的影响尚不明确,仍需继续观察。ATG3基因可能通过提高细胞的线粒体自噬水平,减少DNA损伤,阻止了细胞进一步向白血病细胞转化,降低了细胞的恶性程度。