【目的】免疫排斥反应是导致角膜移植失败的主要原因,是主要由 T 淋巴细胞介导的免疫应答和组织损伤。判断角膜移植的免疫排斥反应有以下几项标准:炎细胞的浸润;植片的水肿、混浊以及新生血管的长入。其中角膜新生血管(CNV)被认为是导致角膜失去透明的主要因素。寻找有效的预防和抑制免疫排斥反应的药物一直是临床面临的难题。故国外的一些学者认为,如果能将抗新生血管药与免疫抑制剂联用,将会在治疗角膜移植排斥反应中开辟出远大的前景。沙利度胺(Thalidomide,THD)又名酞咪哌啶酮,在已往的研究中被认为集抗炎、抗肿瘤、抑制新生血管形成、免疫调节作用等优点于一身,在实验性皮肤、肾脏、心脏和骨髓移植中可以延长移植物的存活时间。本研究建立鸵鸟–兔异种角膜板层移植模型,给予全身应用 THD,观察术后不同时段兔角膜植片的病理变化,外周血中CD4+、CD8+T 细胞的阳性率变化,以及 THD 影响下的 VEGF 基因水平和蛋白水平的表达变化,探讨沙利度胺的抑制 CNV 和免疫调节作用机制,为今后角膜移植术后的临床应用领域提供理论依据。 【方法】将 32 只≦8 周龄的健康新西兰白兔随机分成四组:A 组 8 只兔为兔–兔同种异体板层移植非处理组;B 组为 8 只兔为鸵鸟–兔异种角膜板层移植非处理组;C 组 8 只兔为鸵鸟–兔异种角膜板层移植 THD 治疗组;D 组 8 只兔为鸵鸟–兔异种角膜板层移植强的松治疗组。治疗及观察时间均为 4 周。术后每天在裂隙灯显微镜下观察植片的反应,并按 Holland 标准给植片评分;术后 2 周、3周、4 周各组取 1 只角膜植片行病理学检查;术后 4 周取剩余全部的角膜植片行RT–PCR 和免疫组化检测新生血管形成因子 VEGF 的表达,取角膜植片之前测量CNV 的长度、根数、钟点数及角膜的圆周半径计算 CNV 的面积;术前、术后 1 周、 2<WP=7>第二军医大学 硕士学位论文 中文摘要2 周、3 周、4 周取兔的外周血行流式细胞仪检测 CD4+和 CD8+T 细胞的阳性率。 【结果】 1.各组兔角膜植片的平均存活时间(mean survival time,MST)为:A组 28 天,B 组 15.83±2.483 天,C 组 28 天,D 组 23.33±1.211 天,C 组与 B组间、C 组与 D 组间、B 组与 D 组间差异显著(均为 P﹤0.0001),同时 A 组与 B组间差异也显著(P﹤0.0001)。 2.术后 2 周、3 周、4 周角膜移植片的光镜及电镜结果 A 组:术后 2 周时角膜上皮基底细胞形成很多空泡,在供受体交界处的周围,上皮下浅基质层内可见少量的中性粒细胞浸润,无新生血管增生,胶原纤维(CF)排列疏松,稍紊乱;3 周时基质层内中性粒细胞增多,出现少量增生的 CNV,CF排列较 2 周时整齐;4 周时炎细胞及血管数量进一步增多,CF 排列成束成层。 B 组:术后 2周时角膜上皮基底细胞形成很多空泡,在供受体交界处的周围,上皮增厚,基质层水肿,间质结构疏松,大量中性粒细胞、单核细胞浸润,成纤维细胞含有更丰富的粗面内质网(RER)、微管(MT)、微丝(MF)和发达的高尔基体。基质板层结构破坏,可见较多管腔大小不等的 CNV;3 周时仍有水肿,基质层内仍有较多炎细胞浸润和较多 CNV,纤维组织增生变性,结构紊乱;4 周时炎症反应变化不大,基质层结构比之前整齐,没有束层结构。 C 组:术后 2 周时角膜上皮基底细胞形成空泡,在供受体交界处的周围,基质层内炎细胞浸润不明显,无增生的 CNV;3 周时基质层内可见个别的炎细胞,CF 排列欠整齐;4 周时尚无 CNV,CF 排列规则。 D 组:术后 2周时角膜上皮基底细胞形成很多空泡,在供受体交界处的周围,基质浅层可见少量散在的炎细胞,无增生的 CNV;3 周时基质层增厚,炎细胞增多,出现 CNV,CF 排列紊乱;4 周时 CNV 增多,CF 排列仍稍紊乱。 3.术后 4 周角膜植片基因水平和蛋白水平上 VEGF 的表达 PCR 结果用电泳条带面积×强度值表示,mRNA 含量为 VEGF 条带和β–actin条带的比值。 使用完全随机的方差分析:结果显示,正常组、A 组(同种异体移植非处理组)和 B 组(异种移植非处理组)三组间以及 B 组(异种移植非处理组)、C 组(异种移植 THD 组)和 D 组(异种移植强的松组)三组间 mRNA 含量的差别有统 3<WP=8>第二军医大学 硕士学位论文 中文摘要计学意义(P<0.0001)。用 SNK 法作两两比较结果显示,各组两两比较均有显著差异(P<0.0001),即可以认为 B 组的 mRNA 含量大于 A 组并大于正常组,A 组也大于正常组;同时 C 组的 mRNA 含量小于 D 组且小于 B 组,D 组的 mRNA 含量小于 B 组。 免疫组化结果:正常兔角膜上皮基底膜 VEGF 染色呈淡黄色,为弱阳性(-～+),基质层无着色;A 组角膜上皮基底膜及基质浅层染色呈棕黄色,尤以炎细胞周围为明显,为阳性(+～++);B 组角膜上皮基底膜、上皮下及基质层,基质层血管的血管壁、血管内皮及炎细胞的胞浆染色呈棕褐色,为强阳性(+++～++++);C 组角膜上皮基底膜及基质浅层染色呈微弱的淡黄色,为弱阳性(+);D 组角膜上皮基底膜及基质浅层、基质层血管的血管壁、血管内皮及炎细胞的胞浆染色呈棕黄色,为阳性(++～+++)。 由此?