拟穴青蟹（Scylla paramamosain）,简称青蟹,是我国重要的海水养殖经济蟹类。青蟹缺乏适应性免疫,主要依靠先天性免疫系统中的模式识别受体识别宿主病原体相关分子模式激活免疫反应,抵抗外界病原体侵染。Toll样受体作为一种重要的模式识别受体,能够广泛识别外界致病微生物,但是关于蟹类Toll样受体如何识别病原并激活下游免疫通路的机制还研究得较少。本论文基于实验室前期转录组学数据库分析获得了 7条新的Toll样受体基因序列（SpToll3-9）,针对体内存在如此多的Toll样受体,其在体内的表达特性及其应答病原感染的模式是否一致还是各有特点值得进一步探索。本项研究利用实时荧光定量PCR等技术阐述了SpToll3-9在幼体发育各阶段、正常生长的雌雄成蟹各组织器官中的转录表达特性,以及革兰氏阴性菌溶藻弧菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌感染后青蟹SpToll3-9、Toll通路关键基因和下游抗菌肽的响应表达情况,并在体外原代培养血淋巴细胞,探究多种PAMPs对SpToll3-9转录水平的影响,同时比较分析了SpToll1和SpToll2的表达特性。该研究通过揭示青蟹模式识别受体中Toll样受体的各自免疫特性和可能参与的免疫信号通路,为后续研究Toll样受体在病原微生物感染下参与的免疫调节机制奠定基础。主要结果如下:1.基因克隆与生物信息学分析。基于实验室前期研究结果,从青蟹幼体转录组数据库中获得基因序列,通过PCR及RACE-PCR等技术,克隆获得了青蟹7条新的完整SpTolls基因cDNA序列,与已报道的青蟹SpToll1、SpToll2以及其它虾蟹类Tolls同源,其一致性为30%-80%,因而本次从青蟹克隆获得的同源性序列以此命名为SpToll3、SpToll4、SpToll5、SpToll6、SpToll7、SpToll8、SpToll9。SpToll3-9 全长 cDNA 序列分别为 5033 bp、4825 bp、6504 bp、4932 bp、4427 bp、5245 bp、4421 bp,编码 1229、1371、1555、1370、980、1196 和 976 个氨基酸。SMART蛋白结构域预测显示青蟹SpTolls具有经典Toll结构,包括Toll/白介素-1受体结构域、跨膜区和亮氨酸富集重复序列,除SpToll5外均具有信号肽。系统进化树表明青蟹SpToll3-9分别与已报道的虾蟹类Tolls聚在一起。2.青蟹SpToll3-9在早期幼体发育阶段以及正常生长的雌雄青蟹各组织器官中的转录表达特性。用实时荧光定量PCR检测发现,SpToll3-9包括SpToll1和SpToll2在青蟹幼体发育过程中均表达;SpToll4、SpToll5的表达量同其它SpTolls相比较低;且SpToll1-9均在溞状幼体V期至大眼幼体时期相对表达量显著降低（p<0.01）,表明这9个SpTolls在青蟹幼体发育阶段的转录表达有其规律性。成蟹组织特异性表达结果显示SpToll3-9的转录表达除性腺外无明显性别差异,SpToll3、SpTol14、SpToll7、SpToll8在鳃中高表达,SpToll5、SpToll6、SpToll9在肝胰腺中高表达。在青蟹各性腺器官中,SpToll5、SpToll7、SpToll8在雌蟹卵巢中高表达;SpToll3-9在雄蟹性腺器官中均表达,尤其在精巢中的表达量较其它大部分组织高。3.青蟹SpToll3-9在体外原代培养血淋巴细胞中的转录表达。成功建立青蟹血淋巴细胞原代培养方法,分别用LPS、LTA、Poly（I:C）、PGN、Glucan等不同成分刺激细胞,用实时荧光定量PCR检测发现SpToll3、SpToll6、SpToll9可被LPS、LTA诱导表达;还发现体外细胞试验与人工感染溶藻弧菌和金黄色葡萄球菌的试验结果一致均可诱导SpToll9的转录表达。另外,SpToll2还可被LPS、LTA、Poly（I:C）和 Glucan 显著诱导。4.LPS刺激和溶藻弧菌感染青蟹大眼幼体后SpToll3-9的转录表达及其Toll信号通路关键因子和抗菌肽的响应表达模式。分别用LPS和溶藻弧菌浸泡大眼幼体,实时荧光定量PCR检测发现SpToll4仅在溶藻弧菌感染后显著下调;而SpToll3、SpToll6、SpToll8、SpToll9在LPS刺激和溶藻弧菌感染后表达量均出现下调现象。Myd88仅在溶藻弧菌感染后12 h显著上调。此外,LPS刺激大眼幼体后抗菌肽Crustin2、Lysozyme的转录水平显著下降、Arasin显著上升,Crustin1、ALF2、Hyastatin的响应表达模式类似,均在感染前期（3h、6h）显著上调,而在后期（18 h、24 h）又显著下调;溶藻弧菌感染后会显著诱导Crustin1、Crustin2、ALF2的上调表达,但显著抑制Hyastatin、Lysozyme、Arasin的转录水平。说明不同抗菌肽的调控表达可能通过但不仅限于Toll参与的信号通路,且细菌成分和活菌会诱发青蟹体内不同的免疫响应机制。5.革兰氏阴性菌溶藻弧菌感染成年雄蟹后SpToll3-9的转录表达及其Toll信号通路关键因子和抗菌肽的响应表达模式。用实时荧光定量PCR检测发现,溶藻弧菌感染后SpToll3-9在不同组织中的诱导表达模式有差异。在鳃中可显著诱导SpToll6、SpToll8、SpToll9的转录表达;在肝胰腺中可显著诱导SpToll6、SpToll9的转录表达;在血淋巴细胞中可显著诱导SpToll9的转录表达,但显著抑制SpToll6的转录表达;在性腺精巢中均没有诱导表达。此外,SpToll1在鳃和肝胰腺中被显著诱导,在血淋巴细胞被显著抑制;SpToll2在鳃和血淋巴细胞中表达量均上调。同时发现,Toll信号通路关键因子Dorsal在血淋巴细胞中显著上调表达,Myd88在肝胰腺中显著上调、血淋巴细胞中显著下调。此外,溶藻弧菌感染后Crustin2、Lysozyme、ALF2等抗菌肽相对表达量显著上升,Hyastatin显著下降。实验结果表明,青蟹在受到革兰氏阴性菌溶藻弧菌感染后可能通过SpToll1、SpToll2、SpToll6、SpToll8、SpToll9介导的Toll信号通路激活下游Crustin、Lysozyme、ALF等抗菌肽的表达。6.革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌感染成年雄蟹后SpToll3-9的转录表达及其Toll信号通路下游关键因子和抗菌肽的响应表达模式。用实时荧光定量PCR检测发现,金黄色葡萄球菌感染后,在鳃中可显著诱导SpToll7、SpToll9的转录表达;在血淋巴细胞中可显著诱导SpToll4、SpToll9的转录表达;在肝胰腺中SpToll3-9均无显著性变化。与革兰氏阴性菌溶藻弧菌感染试验结果进行比较发现,SpToll9在血淋巴细胞和鳃中的表达量可被两种菌显著诱导;SpToll6仅在革兰氏阴性菌溶藻弧菌感染后诱导表达,而SpToll7仅显著响应阳性菌金黄色葡萄球菌的感染;SpToll3、SpToll5则在两种病原入侵时均无显著性差异变化,即对病原细菌的感染无响应;此外,两种菌感染后均可抑制SpToll1在血淋巴细胞中的转录水平。Dorsal和Myd88在金黄色葡萄球菌感染后也无显著诱导表达,但下游ALF、Crustin等抗菌肽表达量却显著提高,表明抗菌肽抗病原菌感染的免疫应答途径不仅限于SpTolls参与的信号通路,存在其它调节机制。