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目的:
苯甲酸钠(sodium benzoate,SB),即苯甲酸的钠盐,是目前我国乃至全世界普遍采用的食品和饮料防腐剂之一,近年来的研究对其生物安全性不断提出了新的质疑。而SB的神经毒性尤其是对于多巴胺能神经元的毒性目前尚未见研究报道。本课题以斑马鱼为活体模型,观察SB对多巴胺能神经元早期发育的影响及相关的行为学变化;并以大鼠PC12肾上腺嗜铬细胞瘤细胞作为体外模型,观察SB对哺乳动物多巴胺能神经元的损伤以及在此条件下细胞MAPK信号通路活化表达的特点,为进一步了解SB的神经毒性及相关的分子机制提供实验依据。
实验方法:
1.成年斑马鱼的繁殖饲养及受精卵的生产、孵化:成年斑马鱼按照标准程序饲养,水温在28.5℃,光照/黑暗周期(h)14:10;斑马鱼胚胎通过自然交配获得,并在28.5℃的卵水中进行孵化;
2.通过形态学观察检测SB对2hpf胚胎的发育毒性影响:将胚胎暴露于不同浓度的SB(0~800μg/ml)并持续不同的暴露时间,每隔24h统计生存率及畸形发生情况;
3.通过整体原位杂交检测TH和DAT mRNA在3dpf斑马鱼胚胎中的表达,以及利用整体免疫荧光检测TH蛋白在3dpf斑马鱼胚胎中的表达,来比较SB和MPTP对斑马鱼间脑腹侧DA能神经元的损伤作用;
4.通过行为学检测观察SB对6dpf斑马鱼幼鱼活动能力的影响;
5.大鼠PC12肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的培养、传代,及生物学特性研究:PC12细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基中,至90%融合时用胰酶消化,调节细胞密度为(3~5)×105/ml传代;分别计数培养0~8d的细胞数,并绘制细胞生长曲线,计算细胞群体倍增时间;
6.利用免疫荧光法检测PC12细胞中NF200及TH的表达;
7.饥饿同步化处理后的第3~4代细胞,通过形态学观察SB对PC12细胞形态发育的影响;用MTT法检测SB对PC12细胞活性的影响;通过Western blot的方法观察不同浓度(10~50mM) SB作用对PC12细胞TH表达水平的影响;进一步用DAPI染色和流式细胞术证实SB可诱导PC12细胞发生凋亡,并比较不同浓度(10~50mM) SB所致PC12细胞凋亡率的差异;
8.用Western blot方法检测不同浓度(10~50mM) SB作用于PC12细胞24h后,JNK和ERK磷酸化水平的变化;以及40mM SB作用于PC12细胞(0~24h)后,JNK和ERK磷酸化水平的变化;
9.用Western blot方法检测JNK的特异性抑制剂SP600125预处理30min,再加入SB分别作用1h和3h后,JNK和ERK磷酸化水平的变化。
结果:
1.建立了适合本实验室条件的斑马鱼繁育系统,并能顺利获得满足下游实验要求的高质量的受精卵;
2.在斑马鱼胚胎发育的各个时期,低浓度SB(40μg/ml)处理后未见明显降低胚胎的生存率(P>0.05);然而,随着SB暴露持续时间的延长以及浓度的增加(从100到800μg/ml),生存率明显降低;
3.SB暴露能够引起心包浮肿、卵黄囊再吸收迟缓、卵黄囊水肿、体长缩短、脊柱弯曲等明显的畸形改变;同时,胚胎的畸形率随着SB浓度的增加而增加;
4.斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的SB(40和100μg/ml)至3dpf能够明显下调TH基因在腹侧间脑神经元中的表达(对照组100±7.2%比51.42±4.1%和36.78±4.59%,分别以40和100μg/ml SB处理;P<0.001,与对照组相比);与40μg/ml SB处理组相比,100μg/ml组的作用明显更为剧烈(P<0.001);在阳性对照组中,MPTP(45μg/ml)能够明显下调TH基因在腹侧间脑神经元的表达(P<0.001,与对照组相比);与TH的转录表达模式一致,在免疫荧光检测中SB同样使TH蛋白在间脑神经元中的表达明显降低;
5.与观察到的SB诱导TH表达下调一致的是,SB同样能够诱导腹侧间脑神经元中DAT的表达发生明显下调(对照组100±8.8%比56.44±8.8%、41.13±3.9%、48.83±7.3%,分别对应于40μg/ml SB、100μg/ml SB,和45μg/ml MPTP处理;P<0.001,与对照组相比);并且SB100μg/ml的下调作用比40μg/ml组要更为严重(P=0.002);
6.SB的暴露处理引起斑马鱼幼鱼活动能力的明显降低(P<0.001,与对照组相比);且在相同浓度SB暴露状态下,SB的早期暴露要比晚期暴露的作用影响更为明显(P<0.001);
7.普通培养条件下的PC12细胞贴壁生长,胞体较小,胞核大,圆形,多为单核,偶可见双核或核分裂相,核浆比大,有较多突起;体外培养的PC12细胞群体倍增时间为(24.71±0.59)h;免疫荧光显示,PC12细胞NF200和TH的表达均为阳性;
8.SB可呈时间和浓度依赖性降低细胞活性;其中40mM SB作用24h后对PC12细胞的活性抑制率为47.81±5.23%;
9.低浓度(10mM)的SB可增强PC12细胞中TH的表达,而高浓度(40~50mM)的SB则可降低TH的表达;同时,SB可呈时间依赖性降低TH的表达;
10.SB可诱导PC12细胞核形态呈凋亡改变;进一步利用FACS检测,可发现细胞凋亡所形成的亚二倍体凋亡峰,其峰值随SB浓度的增加而增加;
11.SB以浓度依赖性增加PC12细胞JNK的磷酸化水平,同时以浓度依赖性方式降低细胞中ERK的磷酸化水平;
12.40mM SB作用(0~24h),1h时即引起JNK的磷酸化,3h达到高峰,6h时虽略有下降,但仍明显高于对照组,随后的时间里又持续高表达;而同样处理条件下,ERK的磷酸化水平在6h时突然降低,此后的时间里虽稍有增加,但仍低于对照组水平;
13.JNK抑制剂SP600125的预处理,在SB作用1h时能明显降低SB所致的JNK的磷酸化水平增加;但到3h时,SP600125对JNK的激活抑制作用已无统计学差异(P>0.05);不过,SP6000125的预处理,短时间内(3h)对SB作用下的PC12细胞ERK的磷酸化无明显影响。
结论:
1.SB的暴露处理导致斑马鱼胚胎的生存率以时间和浓度依赖性的方式明显降低,同时畸形率呈浓度依赖性增加;
2.SB能够诱导斑马鱼胚胎间脑DA能神经元TH和DAT的表达明显下调;并且这种DA能神经元基因的表达下调呈浓度依赖性;
3.SB的暴露处理会引起斑马鱼幼鱼活动能力的明显下降,并且这种下降与暴露时期相关;
4.SB能够抑制PC12细胞的增殖,影响多巴胺的合成过程并诱发凋亡;
5.SB的DA能神经毒性可能是通过阻抑ERK通路引发细胞增殖抑制和上调JNK诱导细胞凋亡实现的。