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第一部分脂肪干细胞的促血管生成作用在甲状旁腺功能减退症中的应用研究
目的：颈部肿瘤尤其甲状腺肿瘤手术治疗中对甲状旁腺的保护仍对临床医生具有很大挑战，甲状旁腺的血管损伤甚至意外切除会导致甲状旁腺功能低下，临床上常采用甲状旁腺自体移植技术作为补救手段。为了提高甲状旁腺移植的效率，本文改良了甲状旁腺组织移植技术，通过合并脂肪衍生细胞，包括基质血管部分细胞(SVF)和脂肪干细胞(ADSC)，探索脂肪衍生细胞对组织移植的作用效果以及具体分子机制。
材料和方法：将大鼠的2枚甲状旁腺和甲状旁腺腺瘤患者切除的甲状旁腺中正常部分切成同等体积大小，合并新鲜分离得到的大鼠SVF移植到裸鼠皮下，建立甲状旁腺组织合并脂肪来源血管机制片段移植的动物模型。对甲状旁腺组织合并SVF移植的动物分别于移植后第0、5、12、19和30天观察记录移植物周围血管形成密度和测量组织大小，蛋白印迹检测移植组织中血管内皮生长因子(VEGF)A、成纤维细胞生长因子(FGF)2、甲状旁腺激素(PTH)表达水平，以及在甲状旁腺发育中至关重要的果蝇眼缺失同源物(Eyes absent, EYA1)的表达，利用酶联免疫反应检测血液中VEGF-A、FGF2和PTH浓度。获取人脂肪组织提取ADSC并进行体外培养，设置不同氧浓度条件，研究低氧条件下ADSC对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移和成管作用的影响，测量上清中相关血管生成因子的水平；并进一步利用甲状旁腺合并ADSC在裸鼠体内移植进行在体实验。实验数据经过t检验和卡方检验评估两组之间的显着差异；单因素方差分析(one-way ANOVA)后，对于方差不齐的数据进行Welch’s矫正。P＜0.05代表具有统计学差异。
结果：功能性成活的甲状旁腺移植物具有更强的微血管密度和更高的VEGF-A表达。实验结果显示SVF组大鼠血清PTH水平(12.50±1.78pg/ml)显著高于对照组的血清PTH水平(6.62±1.24pg/ml，p=0.0368)，SVF组移植组织中VEGF-A和FGF2的表达水平相应增高。体外实验通过ADSC培养，并利用不同氧浓度下的上清液诱导HUVEC的小管形成和细胞迁移，低氧组明显高于正常氧浓度组，同时缺氧处理后促进ADSC细胞增殖。进一步大鼠甲状旁腺裸鼠移植实验中，合并ADSC组明显高于单纯甲状旁腺移植组以及虽合并ADSC但是添加VEGF-A抗体和EYA1抑制剂组。
结论：脂肪来源ADSC和SVF在低氧条件下能够更明显的促进移植物血管生成，本文通过体内和体外实验发现该过程通过EYA1在体内外调节血管生成因子的表达释放，促进血管生成，从而改善甲状旁腺移植的存活。我们的研究提供了一种改善甲状旁腺自体移植的有效方法，旨在应对临床甲状腺手术中甲状旁腺的意外损伤，通过即时甲状旁腺合并脂肪组织来源干细胞自体移植技术预防和治疗术后甲状旁腺功能减退症。
第二部分脂肪来源干细胞诱导分化为甲状旁腺细胞的探索性研究
目的：脂肪干细胞(ADSC)越来越多的应用于临床，包括组织修复、伤口愈合、组织填充、骨骼及软骨分化再生等方面，但是在甲状旁腺细胞诱导分化方面尚未有公开发表的研究。为了对ADSC的多能分化能力进行补充，探索其是否具有向甲状旁腺细胞分化的可能性，本部分进行了一系列体外实验，结合第一部分内容，探讨ADSC对甲状旁腺组织移植的血管促进作用之外是否具有诱导分化作用效果。
材料和方法：从大鼠获取甲状旁腺组织并进行原代细胞培养，从获得知情同意的患者皮下脂肪中提取SVF，培养纯化获得ADSC，经免疫荧光检测细胞表面标记、成骨分化和成脂肪细胞分化诱导等方式验证；并通过细胞培养基上清检测细胞因子分泌情况，进一步验证低氧条件培养下ADSC中VEGF-A的具体浓度；通过定期、定量添加细胞因子活化素A和音速刺蝟基因(Shh)，探索ADSC向甲状旁腺细胞分化可能；采用siRNA技术对ADSC进行EYA1敲减，RT-qPCR和蛋白印记方式探索相关信号通路。所有实验数据均经过统计学分析，t检验用于评估两组之间的显著差异；为了进行更多比较和其他干预，进行了单因素方差分析(one-way ANOVA)，对于方差不齐的数据进行Welch’s矫正。P＜0.05被认为具有显著差异。
结果：实验结果显示ADSC在低氧条件(5%O2)培养下能够释放更多的血管生成因子VEGF-A，体外实验VEGF-A浓度在40ng/ml时促进脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)血管生成能力最强，并且低氧条件促进ADSC的增殖。EYA1敲减后(ADSCEYA1-)的ADSC中EYA1表达降低61-69%(p＜0.001)，HIF1α(p＜0.001)和DACH1(p=0.013,p＜0.05)均相应升高，与EYA1表达水平呈现相反趋势，ADSCEYA1-细胞能够表达更高的血管生成因子VEGF-A。在活化素A和Shh共同刺激下，诱导分化两周后能够观察到ADSC细胞形态改变，对比大鼠甲状旁腺细胞形态，以及免疫荧光检测细胞表面分子标记GCM2和CaSR，发现少数细胞分化诱导为甲状旁腺细胞样细胞，但是培养基上清中PTH未发生显著改变。
结论：脂肪来源ADSC在低氧条件下能够更明显的促进移植物血管生成，EYA1不仅能够调节血管生成因子的表达释放，并且在一定程度上参与ADSC向甲状旁腺样细胞的诱导分化过程。本研究在一定程度首次证实脂肪来源干细胞能够诱导分化为类甲状旁腺细胞样细胞，具体的分子机制尚需进一步研究证实，但是本研究为甲状旁腺细胞来源提供了另外一种可能。
目的：颈部肿瘤尤其甲状腺肿瘤手术治疗中对甲状旁腺的保护仍对临床医生具有很大挑战，甲状旁腺的血管损伤甚至意外切除会导致甲状旁腺功能低下，临床上常采用甲状旁腺自体移植技术作为补救手段。为了提高甲状旁腺移植的效率，本文改良了甲状旁腺组织移植技术，通过合并脂肪衍生细胞，包括基质血管部分细胞(SVF)和脂肪干细胞(ADSC)，探索脂肪衍生细胞对组织移植的作用效果以及具体分子机制。
材料和方法：将大鼠的2枚甲状旁腺和甲状旁腺腺瘤患者切除的甲状旁腺中正常部分切成同等体积大小，合并新鲜分离得到的大鼠SVF移植到裸鼠皮下，建立甲状旁腺组织合并脂肪来源血管机制片段移植的动物模型。对甲状旁腺组织合并SVF移植的动物分别于移植后第0、5、12、19和30天观察记录移植物周围血管形成密度和测量组织大小，蛋白印迹检测移植组织中血管内皮生长因子(VEGF)A、成纤维细胞生长因子(FGF)2、甲状旁腺激素(PTH)表达水平，以及在甲状旁腺发育中至关重要的果蝇眼缺失同源物(Eyes absent, EYA1)的表达，利用酶联免疫反应检测血液中VEGF-A、FGF2和PTH浓度。获取人脂肪组织提取ADSC并进行体外培养，设置不同氧浓度条件，研究低氧条件下ADSC对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移和成管作用的影响，测量上清中相关血管生成因子的水平；并进一步利用甲状旁腺合并ADSC在裸鼠体内移植进行在体实验。实验数据经过t检验和卡方检验评估两组之间的显着差异；单因素方差分析(one-way ANOVA)后，对于方差不齐的数据进行Welch’s矫正。P＜0.05代表具有统计学差异。
结果：功能性成活的甲状旁腺移植物具有更强的微血管密度和更高的VEGF-A表达。实验结果显示SVF组大鼠血清PTH水平(12.50±1.78pg/ml)显著高于对照组的血清PTH水平(6.62±1.24pg/ml，p=0.0368)，SVF组移植组织中VEGF-A和FGF2的表达水平相应增高。体外实验通过ADSC培养，并利用不同氧浓度下的上清液诱导HUVEC的小管形成和细胞迁移，低氧组明显高于正常氧浓度组，同时缺氧处理后促进ADSC细胞增殖。进一步大鼠甲状旁腺裸鼠移植实验中，合并ADSC组明显高于单纯甲状旁腺移植组以及虽合并ADSC但是添加VEGF-A抗体和EYA1抑制剂组。
结论：脂肪来源ADSC和SVF在低氧条件下能够更明显的促进移植物血管生成，本文通过体内和体外实验发现该过程通过EYA1在体内外调节血管生成因子的表达释放，促进血管生成，从而改善甲状旁腺移植的存活。我们的研究提供了一种改善甲状旁腺自体移植的有效方法，旨在应对临床甲状腺手术中甲状旁腺的意外损伤，通过即时甲状旁腺合并脂肪组织来源干细胞自体移植技术预防和治疗术后甲状旁腺功能减退症。
第二部分脂肪来源干细胞诱导分化为甲状旁腺细胞的探索性研究
目的：脂肪干细胞(ADSC)越来越多的应用于临床，包括组织修复、伤口愈合、组织填充、骨骼及软骨分化再生等方面，但是在甲状旁腺细胞诱导分化方面尚未有公开发表的研究。为了对ADSC的多能分化能力进行补充，探索其是否具有向甲状旁腺细胞分化的可能性，本部分进行了一系列体外实验，结合第一部分内容，探讨ADSC对甲状旁腺组织移植的血管促进作用之外是否具有诱导分化作用效果。
材料和方法：从大鼠获取甲状旁腺组织并进行原代细胞培养，从获得知情同意的患者皮下脂肪中提取SVF，培养纯化获得ADSC，经免疫荧光检测细胞表面标记、成骨分化和成脂肪细胞分化诱导等方式验证；并通过细胞培养基上清检测细胞因子分泌情况，进一步验证低氧条件培养下ADSC中VEGF-A的具体浓度；通过定期、定量添加细胞因子活化素A和音速刺蝟基因(Shh)，探索ADSC向甲状旁腺细胞分化可能；采用siRNA技术对ADSC进行EYA1敲减，RT-qPCR和蛋白印记方式探索相关信号通路。所有实验数据均经过统计学分析，t检验用于评估两组之间的显著差异；为了进行更多比较和其他干预，进行了单因素方差分析(one-way ANOVA)，对于方差不齐的数据进行Welch’s矫正。P＜0.05被认为具有显著差异。
结果：实验结果显示ADSC在低氧条件(5%O2)培养下能够释放更多的血管生成因子VEGF-A，体外实验VEGF-A浓度在40ng/ml时促进脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)血管生成能力最强，并且低氧条件促进ADSC的增殖。EYA1敲减后(ADSCEYA1-)的ADSC中EYA1表达降低61-69%(p＜0.001)，HIF1α(p＜0.001)和DACH1(p=0.013,p＜0.05)均相应升高，与EYA1表达水平呈现相反趋势，ADSCEYA1-细胞能够表达更高的血管生成因子VEGF-A。在活化素A和Shh共同刺激下，诱导分化两周后能够观察到ADSC细胞形态改变，对比大鼠甲状旁腺细胞形态，以及免疫荧光检测细胞表面分子标记GCM2和CaSR，发现少数细胞分化诱导为甲状旁腺细胞样细胞，但是培养基上清中PTH未发生显著改变。
结论：脂肪来源ADSC在低氧条件下能够更明显的促进移植物血管生成，EYA1不仅能够调节血管生成因子的表达释放，并且在一定程度上参与ADSC向甲状旁腺样细胞的诱导分化过程。本研究在一定程度首次证实脂肪来源干细胞能够诱导分化为类甲状旁腺细胞样细胞，具体的分子机制尚需进一步研究证实，但是本研究为甲状旁腺细胞来源提供了另外一种可能。