软骨组织结构简单,无血管神经长入,因此自身修复能力有限。传统的软骨缺损治疗方法各有局限性且不能完全恢复软骨组织的功能性,因此,利用组织工程方法构建骨软骨仿生组织复合物是未来解决大面积骨软骨缺损的最佳方法之一。本实验采用生物相容性强、与人体骨组织结构及性能相似的猪源骨松质脱脂、脱钙、脱蛋白后作为骨部分仿生支架,将壳聚糖明胶混合冻干并交联后构建壳聚糖-明胶水凝胶支架作为软骨部分仿生支架。在构建的水凝胶/松质骨支架上分别接种骨细胞软骨细胞方向诱导分化后的脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells, ADSCs)后,构建双层骨软骨复合物并检测其用于骨软骨修复中的可行性。首先,制备骨松质支架,检测其孔径分布、孔隙率,扫描电镜观察其表面形貌并利用红外检测其化学组成。扫描电镜观察发现骨松质支架表面有大量纳米级突起,骨松质支架内孔道连通,支架的平均孔径为410±59μm,孔隙率为70.64±1.71%。通过红外检测发现,骨松质支架内含有羟基磷灰石与蛋白质等有机物质。制备不同浓度的壳聚糖/明胶水凝胶支架并检测不同浓度下支架的孔隙率、溶胀率及降解率,选择综合性能最优的浓度用于制备本实验所需的水凝胶支架。观察最佳浓度组水凝胶支架的孔径、微观形貌并用红外检测分析交联前后壳聚糖/明胶的化学组成变化。本研究水凝胶中明胶与壳聚糖的质量比为3：1,设置3%,4%,5%三组不同浓度的水凝胶。经相关物理性能检测,发现4%浓度组水凝胶支架的孔隙率、溶胀率及降解率等综合性能最优,最适合作为软骨仿生支架。4%浓度组水凝胶支架内孔道间相互连通,水凝胶的平均孔径为117±21μm,孔隙率为83.40±0.79%,溶胀率为362.00±2.38%,PBS浸泡法测得6周后支架剩余重量为起始干重的80.76±1.6%。红外检测表明水凝胶支架交联后明胶与壳聚糖的官能团发生了化学反应。骨松质支架与水凝胶支架的各项物理性能与原位骨软骨组织的物理性能相似。此外,松质骨及壳聚糖/明胶还具有良好的生物相容性。种子细胞采用分离纯化后的人ADSCs,体外培养扩增并向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞诱导分化后,检测细胞的生长状况、形态变化,并用常规染色检测分化效果。分离纯化后的ADSCs呈长梭形贴壁生长,增殖速度快,5～6天可传代一次。脂肪培养中诱导培养两周后,细胞形态发生变化,油红染色可见细胞内有红色小油滴。软骨培养基中诱导培养三周后,甲苯胺蓝染色发现软骨细胞分泌的多糖类胞外基质被染为淡紫色。骨诱导培养后,实验组的ALP染色、von Kossa染色及茜素红染色均呈现阳性,而对照组不被染色或染色不明显。综合以上可得,ADSCs扩增速度快、一定代数范围内形态稳定,可分化为脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞,适于作为骨软骨复合物构建的种子细胞。在两部分支架材料制备及性能检测与种子细胞扩增及分化能力检测的基础上,将种子细胞与支架复合构建骨软骨复合物。首先将诱导分化后的ADSCs以1×107cells/mL的密度分别接种在骨松质及水凝胶支架上,孔板内分离培养两周后构建骨软骨复合物。复合物的构建分为三组：双层仿生支架复合培养实验组,分离培养对照组及空白支架组。共培养两周后,倒置显微镜下观察支架内的细胞生长状态,Dead/Live荧光染色观察细胞在支架上的生长增殖状态并用IpWin5软件分析染色情况及细胞活性,茜素红染色观察骨松质支架上的骨向分化能力情况。扫描电镜观察实验组水凝胶支架及骨松质支架上细胞的生长贴附状态及胞外基质分泌情况。共培养后,倒置显微镜检查结果表明ADSCs在支架上黏附良好,可见不同尺寸的细胞群落。IpWin5软件分析Dead/Live荧光染色的光密度及染色面积,t-检验检测显著性。软骨支架上实验组与对照组的累计光密度分别为350059dpi、163129dpi, P<0.005。骨支架上实验组与对照组的累计光密度分别为306222dpi、31595dpi, P<0.005。骨支架上实验组与对照组细胞的荧光染色面积分别为14815.10μm2、1412.13μm2, P<0.005。软骨支架上实验组与对照组细胞的荧光染色面积分别为16836.96μm2、7829.27μm2, P<0.005。复合支架组(实验组)的细胞荧光染色面积及累计光密度与对照组有显著性差异,表明实验组比单层培养对照组的细胞生长增殖能力强。茜素红染色结果表明实验组骨松质支架上的染色比对照组深。用扫描电镜观察构建的复合物发现细胞生长在水凝胶及骨松质支架的孔道内,以细胞集簇的方式存在。骨松质支架上可见无机盐及骨晶等胞外分泌物,水凝胶支架表面亦可见大量分泌物。以上检测表明,双层支架构建的骨软骨复合物比单层仿生支架的构建效果好,因此,本实验中制备的双层支架可用于组织工程骨软骨复合体的构建。