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反向遗传技术(Reverse genetics)是与经典遗传学研究思路相反的一个概念,是采用由基因型到表型的研究策略,通过基因克隆引入定点突变或利用遗传重组技术等研究基因修饰对表型的影响。流感病毒反向遗传技术不仅在流感病毒致病机理的研究中发挥着重要的作用,在构建新型的疫苗领域也取得了骄人的成绩。本文以H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus, ATV) A/Chicken/Shanghai/F/98(C/SH/F/98,简称F株)的NA基因为载体,分别插入报告基因荧光蛋白GFP和鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)的S1基因,形成2种嵌合NA基因的结构。将嵌合的NA基因插入pHW2000中,与H9N2亚型AIV F株的其余7个基因的转录/表达载体共转染293T细胞。将转染细胞接种SPF鸡胚后,初步获得有血凝价的重组流感病毒rF/NA1245-2A-GFP, rF/NA183-GFP和rF/NA183-S1。1.携带荧光蛋白GFP和S1基因转录/表达载体的构建本部分以F株的NA基因为模板,设计了两种载体结构,分别将报告基因荧光蛋白GFP与IBV S1基因插入到NA基因中,使插入的外源目的基因能与NA基因同步表达。第一种载体是在NA基因的5’端非编码区及其下游的编码区1245nt处插入2A序列和GFP基因,随后连接NA基因编码区1245nt后的157nt及其后的3’端非编码区序列。第二种载体是在NA基因5’端非编码区及其下游编码区183nt处直接插入荧光蛋白GFP基因或IBV S1基因,然后与NA基因3’端非编码区序列及其上游NA基因编码区157nt相连。通过PCR、测序鉴定,将序列正确的载体酶切,插入8质粒系统的pHW2000,最后产生3种NA基因载体,分别为质粒pHWNA1245-2A-GFP、pHWNA183-GFP和pHWNA183-S1。2.利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组病毒将已经构建好的嵌合的NA基因转录/表达载体质粒(pHWNA1245-2A-GFP、 pHWNA183-GFP和pHW183-S1),分别与F株的其余7个基因的转录/表达载体(pHW-PB1、pHW-PB2、pHW-PA、pHW-HA、pHW-NP、pHW-M和pHW-NS)质粒按照1：1比例混匀,组成3种拯救表达外源基因的8质粒重组病毒拯救体系。在拯救含有报告基因GFP重组病毒的过程中,转染质粒后50h可以见到大量的荧光蛋白表达,所转染的细胞接种10日龄SPF鸡胚的第一代尿囊液的血凝价1：24～1：26;含有IBVS1基因的病毒拯救系统转染后的第一代血凝价也是1：24～1：26；第一代含有S1基因的重组病毒的尿囊液在电子显微镜下可见含有纤突囊膜的流感病毒粒子；但是以上重组病毒在10日龄SPF鸡胚进行继续传代时,都失去了血凝特性；其原因还有待进一步研究。