非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种以肝细胞脂肪变性为主要病理特征的临床综合征,其疾病谱包括从单纯的肝脏脂肪变性即非酒精性脂肪肝(NAFL)到非酒精性脂性肝炎(NASH)的一系列病变,后者病理上表现为肝脏脂肪变性,炎症,和不同程度的肝脏纤维化,是NAFLD的一种较为严重的形式。NAFLD是一种与肥胖、胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤,被认为是代谢综合征(MS)在肝脏的表现形式。近年来,全球范围内NAFLD的患病率不断升高,在一些地区已成为终末期肝病和肝移植的首要病因。NAFLD患者罹患心血管疾病和肝癌的风险性也提高。目前尚无针对NAFLD的特效药物。对NAFLD和NASH发病机制和病理生理过程的理解尚不充分,给开发治疗方法带来一定困难。目前认为NAFLD/NASH发病机制遵循“多次打击”假说,即包括脂代谢异常,脂毒性,氧化应激,内质网应激,线粒体功能异常,肠道菌群失调和遗传易感性等多种“打击”,同时作用于肝脏,引起肝脏脂肪变性、炎症反应和纤维化等病变,最终由NAFL进展为NASH甚至终末期肝病。肝细胞的脂肪变性是NASH的重要特征之一。长期高脂饮食一方面使摄入的甘油三酯(TG)增多,另一方面诱发的胰岛素抵抗(IR)使脂肪的水解和从头合成都增强,导致肝脏游离脂肪酸(FFA)含量增加。过量的FFA被酯化为TG,以脂滴的形式存在于肝细胞中。当其含量超出脂滴的存储能力,FFA将对肝细胞产生脂毒性,并引起氧化应激和内质网应激。应激反应进一步引起肝细胞的脂代谢紊乱。FFA和肠道菌群产生的内毒素(LPS)可激活NF-κB等转录因子,分泌促炎因子和趋化因子,激活肝脏定植的巨噬细胞Kupffer细胞(KCs),并招募循环中的单核/巨噬细胞进入肝脏,进一步加强肝脏炎症反应。KCs可通过TGF-β通路激活肝脏星形细胞(HSCs),使其活化成为肝脏肌成纤维细胞(HMFs),后者为重要的胶原蛋白来源,促进了肝脏纤维化。纤维化形成的缺氧环境又促进了肝脏病理性血管新生。由上述可见,脂肪变性、炎症和纤维化等病理过程相互影响,促进了NASH的发展。NF-κB是一种重要的转录因子,可调控多种细胞凋亡和炎症相关的基因表达,在NASH的发病过程中起到重要作用。NF-κB在静息状态下与抑制因子IκB结合,当后者被IκB激酶(IKK)激活并水解后,NF-κB被活化,其p65亚基被磷酸化,并转入细胞核,与目的基因的启动子结合,调控基因转录。PPARα也是一种重要的转录因子,主要调节FA的转运和线粒体的β氧化,对肝脏炎症和纤维化也有调节作用。PPARα可直接与NF-κB的p65亚基相结合,阻止后者与其目的基因结合,从而下调基因表达水平。PPARα也可通过促进IκB的表达来抑制NF-κB的活性。由于NF-κB可上调多种促炎因子的表达,因此PPARα可能通过对NF-κB的负向调控来发挥抑炎作用。SIRT1是一种NAD+依赖的去乙酰化酶,可以通过提高PPARα活性,上调脂肪酸氧化(FAO)和下调促脂肪生成基因的表达。SIRT1可以使NF-κB的Rel/p65亚基去乙酰化,降低Rel/p65转录活性,从而抑制了NF-κB的活化,发挥抑炎作用。综上所述,PPARα和SIRT1可能通过对NF-κB通路的抑制,降低促炎因子的表达水平,同时改善肝细胞的脂代谢,从而改善NASH的进展。CD47分子,也被称为整合素相关蛋白(IAP),广泛表达于多种细胞表面。CD47与其内源性配体血小板反应蛋白(TSP-1)相结合,抑制NO对内皮细胞(ECs)和血管平滑肌细胞(VSMCs)的作用,抑制血管新生,减少血流量。已有研究表明,TSP-1/CD47通路参与到缺血再灌注损伤和动脉粥样硬化的发病过程中。CD47也可与表达在巨噬细胞表面的信号调节蛋白(SIRP-α)相互作用,抑制巨噬细胞的吞噬作用,发挥自体标识作用,并在移植免疫中发挥重要作用。目前有研究表明,在HFD诱导的肥胖小鼠模型中,CD47KO小鼠与野生型(WT)小鼠相比,可以抵抗高脂饮食带来的体重增加,并减少了肝脏组织脂肪含量,其中巨噬细胞浸润减少,炎症反应下降,葡萄糖糖耐量及胰岛素敏感性均有所提高。这些数据揭示了CD47在肥胖形成和相关代谢综合征方面的新的功能。我们前期的工作显示,HFD喂养的CD47KO小鼠体重及皮下脂肪含量均较WT小鼠有所下降,但肝脏脂肪含量增加,与既往研究有所不一致。因此我们设计如下实验,试图进一步探究CD47分子在NASH发病机制中的作用。我们以CD47KO和C57BL/6(WT)小鼠为研究对象,给予高脂饮食(HFD)喂养,持续40周,建立小鼠NASH模型。喂养期间每月测量体重,并与基线体重相减,得到每月体重增长。在指定时间点解剖小鼠,观察皮下脂肪和肝脏大体情况,并进行相应取材。首先,我们对肝脏进行病理组织学检查,通过H&E和油红O染色观察小鼠肝脏脂肪堆积情况,并测量小鼠肝脏TG含量,定量分析小鼠肝脏脂肪性变的严重程度。同时测量了小鼠血清ALT水平,用来评估肝脏损伤程度。为探究小鼠肝脏脂肪性变的发生机制,我们测量了小鼠血清中的TC,HDL和LDL含量,并用q RT-PCR的方法测量了肝脏载脂蛋白Apo A1,Apo B,Apo C2和MTTP的m RNA表达水平。随后,我们通过对小鼠肝脏切片进行天狼星红染色,观察胶原蛋白沉积情况,并测量了肝脏促纤维化细胞因子TGF-β的基因和蛋白表达情况,以及TGF-β的激活物TSP-1的m RNA水平。接下来,我们用免疫荧光染色的方法,观察小鼠肝脏切片CD31+Tie+血管内皮细胞的数量和分布,以此分析肝脏微血管密度,并结合CD31和VEGFR的m RNA水平,评估小鼠肝脏血管新生的情况。最后,我们对小鼠NASH模型中肝脏炎症反应的情况进行了观察。通过q RT-PCR的方法测量了IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-10和CCL2等基因的表达情况,并用免疫印迹法测量了IL-6,IL-10和CCL2的蛋白表达量。除促炎因子和趋化因子外,我们还用免疫荧光染色的方法观察了肝脏CD68+巨噬细胞的浸润情况。明确了CD47KO小鼠肝脏炎症反应激活的状态。如前所述,NF-κB是调节炎症反应重要的转录因子,因此我们也通过免疫印迹和免疫荧光的方法分别测定了NF-κB的磷酸化和核转位情况,以此来分析其活化程度。为研究CD47KO小鼠中炎症反应激活的机制,我们测量了小鼠肝脏PPARα和SIRT1两种可调节NF-κB活性的转录因子的基因表达情况。实验结果发现,在HFD诱导的小鼠肝脏NASH模型中,与WT小鼠相比,CD47KO小鼠:1.CD47KO小鼠体重增长和皮下脂肪堆积均减少,但肝肿大更为严重,肝重/体重比增加。病理组织学实验结果显示肝脏脂滴体积增大,数量增多。肝脏TG含量升高。提示在CD47KO小鼠,HFD诱导的肝脏脂肪变性更为严重。2.尽管在低脂饮食(LFD)条件下CD47KO小鼠载脂蛋白表达量较高,但HFD显著下调了载脂蛋白的表达,且CD47KO与WT小鼠下调程度相当。这说明在CD47KO小鼠中观察到的明显加重的肝脏脂肪变性不能用载脂蛋白的表达量变化来解释。3.CD47KO小鼠肝脏纤维蛋白沉积增加,促纤维化的细胞因子TGF-β和TSP-1的表达量增多,表明肝脏纤维化程度加重。免疫荧光结果显示CD31+Tie+血管内皮细胞的数量增加,微血管密度增大,且CD31和VEGFR的m RNA表达上调,提示CD47缺失促进了纤维化伴随的血管新生。4.CD47KO小鼠肝脏的炎症反应更为强烈,表现为IL-1β,TNF-α,IL-6等促炎因子表达量增加,IL-10等抑炎因子表达量减少。除细胞因子外,CD68+巨噬细胞浸润增多,招募巨噬细胞的趋化因子CCL2的表达量也增加。NF-κB作为重要的炎症调节因子,其p65亚基的磷酸化和核转位都增加,表明在CD47KO小鼠中,NF-κB的活化程度增强。5.PPARα和SIRT1是调节炎症反应和脂类代谢的重要因子,它们都可通过对NF-κB的负向调节发挥抑炎作用。在LFD条件下,CD47KO小鼠中这两种分子的表达量高于WT小鼠。但HFD显著抑制了这两种分子在CD47KO小鼠中的表达。提示CD47缺失可能是通过抑制了PPARα和SIRT1的活性,间接促进了NF-κB的活性,从而上调了一系列炎症因子和纤维化因子的表达,促进了肝脏炎症反应。综上所述,本研究结果提示,CD47可能通过对炎症和脂代谢的调节因子PPARα和SIRT1的抑制作用,激活了肝脏细胞NF-κB信号通路,上调了下游炎症和纤维化相关基因的表达,从而促进了HFD诱导的脂性肝炎的进展。