幼龄反刍动物的生长发育决定了反刍动物长期的生长性能。其中,开食料采食和断奶是幼龄反刍生长发育过程中的重大挑战,开食料适应性与断奶期间的生长性能水平直接决定了幼龄反刍动物能否健康发育。瘤胃是固体饲料消化的重要器官,其自身的器官发育和瘤胃中微生物的定植是瘤胃消化利用开食料等固体饲料的基础。因此,调控瘤胃微生物定植过程可能促进开食料消化并缓解断奶应激。本研究通过新鲜瘤胃液移植的方式,探究了移植的时间点、频率、方式对移植效果的影响。同时,通过添加瘤胃内容物冻干粉实现稳定、多次的移植刺激,探究其对断奶前和断奶期间幼龄反刍动物生长性能、健康、代谢和瘤胃微生物定植过程的影响。本研究为实现幼龄反刍动物早期微生物调控提供了理论和试验依据,进一步为实现微生物移植促进反刍动物高效生产提供了系统性指导。1瘤胃微生物移植时间窗口期和移植效果探究试验选取15只三胞胎羔羊并随机分为三组,每组包含5只不同胎的羔羊。出生后,羔羊与母羊立即分离,人工采集并使用奶瓶人工饲喂羔羊初乳。3日龄时,每天分三次饲喂代乳料。21日龄后,所有羔羊自由采食开食料,同时,在3天内将代乳料饲喂量减少至完全断奶。移植当天自口腔采集5只成年湖羊瘤胃液,混合后厌氧保存待用。一组羔羊在8、9、15、16日龄时移植当天采集的新鲜瘤胃液（IBW组）,另一组羔羊在22、23日龄时移植新鲜瘤胃液（IDW组）,剩余的一组羔羊在8、9、15、16、22、23日龄同样移植等量生理盐水作为对照组（C）。测定羔羊每周的平均采食量、日增重和粪便评分等。所有羔羊在28日龄屠宰,采集瘤胃、结肠内容物样品进行后续分析。结果显示,与对照组相比,无论是断奶前还是断奶后移植新鲜瘤胃液均不能显著改变羔羊的采食量、瘤胃发酵参数和日增重。此外,移植新鲜瘤胃液无法显著减少羔羊腹泻的发生频率。然而,微生物组成的结果表明,移植后来自Moryella、Acetitomaculum、Tyzzerella4、Succiniclasticum、Prevotella 1、Lachnospiraceae、Christensenellaceae R-7 group、Family ⅩⅢ AD3011 和 Bacteroidales S24-7 的 OTUs 在 IBW 组瘤胃中快速定植;来自 Succiniclasticum、Prevotellaceae UCG-003、Erysipelotrichaceae UCG-004、Prevotella 1、Bacteroidales S24-7 gut group uncultured bacterium和Family ⅩⅢ AD301 1的OTUs在IDW组瘤胃中快速定植。筛选成年动物瘤胃微生物与幼龄动物瘤胃微生物各自的标志微生物与移植后定植的微生物进行共现性分析发现,IBW组中快速定植的微生物之间、其与成年瘤胃标志微生物之间存在共现性。相比于IBW组,IDW组结肠内容物微生物发生相对较大的变化。上述结果表明,早期的瘤胃微生物调控,尤其是开食料采食前进行微生物移植,能够促进部分成熟瘤胃微生物在瘤胃中的定植,并加速瘤胃微生物区系的成熟过程。2饲喂富集成年瘤胃微生物冻干粉对羔羊断奶前后生长性能的影响反刍动物生长发育初期,机体对瘤胃液移植的接受度较好。在生长早期移植的条件下,进行连续、稳定的瘤胃微生物移植刺激可能能够提高移植微生物后的积极效果。此外,为消除瘤胃液中其他组成物质的影响,同时简化瘤胃微生物移植的操作难度,增加生产应用空间,试验二采用瘤胃微生物冻干粉作为添加剂以探究其移植效果。采集成年湖羊瘤胃液,离心去除上清和饲料颗粒,沉淀细胞重新悬浮于10%脱脂奶粉中,制备冻干粉。试验二共选取48只羔羊,随机分为两组,羔羊出生后立即与母羊分离,人工饲喂初乳3天。3日龄时,将母乳替换为代乳料。从5日龄开始,羔羊能够自由采食颗粒开食料并自由饮水。每天记录羔羊的采食量,同时每周测定羔羊的日增重。其中,一组羔羊在5～21日龄时,每天在代乳料中添加1 g提前制备的瘤胃液微生物冻干粉（Inoc）;另一组羔羊同时添加1 g脱脂奶粉平衡养分作为对照（Con）。当羔羊连续3天且每天的开食料采食量超过200 g/d时,其代乳料在一周后停止饲喂并完成断奶。断奶前、断奶时（BW1）、断奶后一周（AW1）、断奶后两周（AW2）分别测定体重、饲料消化率、采食量等。BW1、AW1、AW2时在两组中各随机选取8只羔羊屠宰后,采集瘤胃内容物测定瘤胃发酵参数、瘤胃微生物酶活、消化道和器官发育指标等。结果显示,Inoc显著提高了断奶前干物质、粗蛋白消化率（P<0.05）,有提高NDF（P=0.085）和半纤维素消化率的趋势（P=0.058）。断奶后,Inoc组粗蛋白消化率仍显著高于对照组（P<0.05）,且Inoc组羔羊的料重比相比于对照组有下降的趋势（P=0.086）。断奶后第二周,Inoc组羔羊淀粉消化率有高于对照组的趋势（P=0.056）。瘤胃发酵参数结果显示,断奶后Inoc组羔羊瘤胃中丙酸的比例显著高于对照组,且Inoc组乙酸丙酸比显著小于对照组（P<0.05）;酶活结果显示,Inoc组瘤胃中微生物淀粉酶的活性显著高于对照组;这些结果说明Inoc组羔羊断奶后瘤胃发酵以淀粉-丙酸发酵为主,促进了开食料中淀粉的利用。此外,Inoc组肝脏、瘤胃的重量显著高于对照组（P<0.05）。因此,断奶前饲喂瘤胃微生物冻干粉能够显著提高断奶期间羔羊对开食料的利用率,促进开食料适应,增加瘤胃丙酸供应并缓解羔羊断奶应激。3饲喂富集成年瘤胃微生物冻干粉对羔羊断奶前后瘤胃微生物区系和机体代谢的影响采集中羔羊断奶期间的血液、肝脏组织和瘤胃内容物分别测定血液生化指标、肝脏基因表达和瘤胃微生物组成。血液代谢指标显示,对照组羔羊断奶后NEFA浓度显著降低（P<0.05）,血糖浓度具有降低的趋势,而β-羟丁酸的浓度在断奶后一周时就显著提高（P<0.05）;Inoc组羔羊断奶前后血糖和β-羟丁酸浓度没有显著差异,且β-羟丁酸直到断奶后第二周才显著高于断奶前（P<0.05）。然而,Inoc和断奶都对乳酸、胰岛素、胰高血糖素等指标的浓度没有显著影响。血液指标表明,对照组羔羊在断奶后出现能量负平衡,可能由于对照组羔羊对开食料的利用率较低。肝脏基因表达量分析结果显示,断奶和Inoc均不影响PCK1、PCK2、MCM等基因的表达量,但是Inoc显著提高了断奶后G6PC的表达量,可能提高了肝脏糖异生过程的产糖量,并缓解Inoc组羔羊在断奶过程中的能量负平衡。微生物组成的结果显示,断奶后,对照组羔羊瘤胃微生物发生显著变化,而Inoc组羔羊的瘤胃微生物变化的程度小于对照组,说明Inoc可能促进了一些成熟微生物的定植,减小断奶前后瘤胃微生物的差异。此外,Inoc组羔羊断奶后瘤胃中Mitsukella、Olsenella、Succiniclasticum等微生物的丰度高于对照组,这些微生物与瘤胃中丙酸、血糖浓度都呈显著的正相关关系（q-value<0.1）。不仅如此,微生物的功能预测结果表明,断奶后Inoc组羔羊瘤胃中多糖利用相关的基因显著富集（P<0.05）。微生物网络分析的结果显示,Inoc组羔羊的瘤胃中比对照组羔羊多一个功能模块,该模块中的微生物主要有Prevotellaceae、Succinivibrionaceae、Erysipelotrichaceae等。以上结果表明,饲喂瘤胃微生物冻干粉能够促进多糖利用菌在瘤胃中定植,提高开食料利用率,增加瘤胃中丙酸产量,最终缓解断奶期间羔羊的能量负平衡和断奶应激。4饲喂富集成年瘤胃微生物冻干粉对羔羊瘤胃微生物基因组组成及功能的影响宏基因组分析结果显示,断奶前一周,Inoc组羔羊瘤胃中丰度显著高于对照组的差异基因共有1047个,而显著低于对照组的差异基因共98个。其中,丰度最高的前25个差异功能基因中,SusC、GHs等碳水化合物利用相关的基因丰度显著高于对照组。断奶后一周,Inoc组瘤胃中丰度显著高于对照组的差异基因共有829个,而显著低于对照组的差异基因共180个。其中,SusC、CBM等基因丰度在Inoc组羔羊瘤胃中保持较高水平,同时肽酶、果胶酶的功能基因丰度也在Inoc组中高于对照组。断奶后两周时,两组间差异的功能基因数差异减小,对照组中微生物功能的发育过程落后于Inoc组。碳水化合物相关的功能基因中,断奶前Inoc组GH5、GH13、GH43、GH141、GH142等家族的丰度显著高于对照组,然而断奶后,两组间这些差异的功能基因不再显著。对照组GH5、GH13、GH43、GH142的丰度在断奶后发生显著变化,而Inoc组中则保持相对稳定,与本研究此前的结果一致,Inoc加快了瘤胃微生物的定植过程,使得瘤胃微生物功能基因在断奶前后保持相对稳定。KEGG代谢通路富集结果表明断奶前瘤胃微生物的功能基因显著富集在淀粉和蔗糖利用通路和丙酮酸代谢通路,进一步说明了 Inoc能够提高瘤胃利用开食料的潜能,并在断奶过程中发挥重要作用。综上,早期连续、重复的瘤胃微生物调控能够促进成年湖羊的瘤胃微生物如Mitsukella、Olsenella、Succiniclastcum等微生物在羔羊瘤胃中的定植,促进瘤胃微生物功能的发育和成熟过程,增强断奶前羔羊瘤胃消化开食料的能力,促进开食料的利用并缓解断奶应激。一方面,早期移植应用于生产能够提高反刍动物早期的生长性能,缓解断奶应激导致的能量负平衡,促进幼龄反刍动物的健康发育;另一方面,早期羔羊的瘤胃微生物具有较强的可塑性,后续试验进行早期调控可能改变瘤胃微生物地定植命运,实现长期的促进作用。