研究背景:基于中医药的临床用方经验和现代涨落效应理论,本学科曾提出中医复方进入体内后的多种微量成分共同作用于生物体而产生整体效应的观念,并提出复方作用可能存在“效阈浓度或极低浓度下多成分的生物效应模式”的假说。如果这些推测得到验证,将对包括中医方药效应在内的复杂生命现象的理解提供一个全新的视角,发现极低浓度下的中药多种成分共存下的生物效应的普遍现象也会对包括中、西药在内的新药研制产生革命性的影响。目的:基于学科前期的工作基础,拟以葛根芩连汤方中4味中药所涉及的四种化学成分(葛根素、黄芩素、小檗碱、甘草酸)及其配伍作为该方成分配伍的表征,以2型糖尿病发生发展中的胰岛素抵抗(IR)机制的研究为背景,选择IR的重要靶器官/靶细胞—肝细胞(HepG2细胞)作为探查工具,运用分子生物学检测技术,在观察各单体成分不同浓度对该细胞IR模型的糖代谢作用的基础上,进一步考察其效阈下的极低浓度配伍的抗IR效应及机理,以探讨中药复方多成分低浓度下配伍的生物效应模式,为论证中医方剂效用原理中“极低浓度下的多成分配伍效应”的推测提供新的依据,同时为多成分配方极低浓度条件下的作用机制提供分子水平上的理解。方法:(1)4种单体成分的体外安全浓度范围:取对数生长期的HepG2细胞,接种于96孔板。培养24 h后,弃掉原培养液,加入终浓度分别为10-9、10-8 10-7、10-6、10-5、10-4mol/L葛根素、黄芩素、小檗碱、甘草酸,正常组加入相同体积的培养液;放于37℃、5%CO2培养箱中培养48h。采用CCK-8法检测HepG2细胞增殖活力,得到各单体成分体外安全浓度范围。(2)HepG2 IR细胞模型复制的方法学考察:取对数生长期的HepG2细胞,接种于96孔板。置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后,吸弃培养液,换成无血清的培养基饥饿处理12h,吸弃培养液。正常组加入正常培养基,模型组加入新配制的含25mmol/L葡萄糖和胰岛素浓度分别为1×10-9～1×10-5mol/L的培养基,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h、48h和72h。采用CCK-8法和葡萄糖氧化酶(GOD-POD)法,检测各浓度胰岛素对细胞增殖活力和葡萄糖消耗量的影响,筛选最佳胰岛素作用浓度和作用时间。根据筛选的条件,将细胞置于不含胰岛素的正常培养液培养24h、48h和72h,通过测定细胞葡萄糖消耗量,考察细胞IR模型的稳定性。(3)4种单体成分体外抗IR的浓度-效应范围:取对数生长期的HepG2细胞,接种于96孔板,分为正常组、模型组和给药组。给药组加入终浓度分别为10-11～10-5mol/L葛根素、黄芩素、小檗碱、甘草酸,正常组和模型组加入相同体积的含有25mmol/L葡萄糖细胞培养基;置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。在药物处理24h后,通过测定细胞增殖活力和葡萄糖消耗量,考察4种单体成分体外抗IR的浓度-效应范围。(4)4种单体成分体外抗IR活性及效应机制:将HepG2细胞分为正常组、模型组和给药组。给药组加入不同浓度(10-6和10-5mol/L)的葛根素、黄芩素、小檗碱、甘草酸和二甲双胍(10-3mol/L)溶液,正常组和模型组加入相同体积的细胞培养基;放于37℃、5%CO2培养箱中处理24h。检测指标:1)细胞增殖活性和葡萄糖消耗量;2)糖利用:细胞丙酮酸激酶(PK)和葡萄糖激酶(GCK)活性;3)糖异生:葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)mRNA表达水平;4)糖摄取:细胞胰岛素受体(InsR)mRNA表达水平;5)相关信号通路:磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、葡萄糖转运蛋白-2(GLUT2)mmRNA表达和细胞胰岛素受体底物1(IRS1)、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、GLUT2蛋白表达水平;6)能量代谢:细胞沉默信息调节因子1(SIRT1)、沉默信息调节因子3(SIRT3)mRNA表达和腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α(PGC-1a)、线粒体转录因子A(TFAM)、核因子相关因子2(NRF-2)、肉毒碱棕榈酰基转移酶1(CPT-1)、叉头转录因子1(FOX01)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)蛋白表达水平。(5)4种单体成分效阈浓度下不同配伍的抗IR效应及作用机制:(1)不同效阈浓度下的4种单体成分组合的抗IR效应:将HepG2细胞分为正常组、模型组、各单体各自效阈浓度下(1/4、1/10、1/100、1/1000)的配伍4组以及二甲双胍(10-3mol/L)组。分别加入含相当浓度的各组药物于细胞培养基中;置细胞培养板于37℃、5%C02培养箱中干预24h。检测指标:细胞增殖活力和葡萄糖消耗量。(2)4种单体成分1/100效阈浓度不同配伍的抗IR效应:将HepG2细胞分为正常组、模型组、葛根素(A,10-11mol/L)组、葛根素+黄芩素(A+B,10-11+10-10mol/L)组、葛根素+黄芩素+小檗碱(A+B+C,10 11+10-10+10-11mol/L)组、葛根素+黄芩素+小檗碱+甘草酸(A+B+C+D,10-11+10-10+10-11+10-10mol/L)组、二甲双胍(10-3mol/L)组共 7 组,分别加入含相当浓度的各组药物于细胞培养基中;置细胞培养板于37℃、5%CO2培养箱中24h。检测指标:细胞葡萄糖消耗量;细胞PK、GCK和GLUT2活性。(3)4种单体成分效阈浓度下的低浓度配方(1/100和1/10)的抗IR作用机制:将HepG2细胞分为正常组、模型组、1/100 低浓度配方(A+B+C+D,10-11+10-10+10-11+10-10mol/L)组、1/10 低浓度配方(A+B+C+D,10-10+10-9+10-10+10-9mol/L)组、二甲双胍(10-3mmol/L)组,分别加入含相当浓度的各组药物于培养基中,放于37℃、5%CO2培养箱中24h。检测指标:1)糖异生:细胞 G6Pase、PEPCK mRNA 表达水平;2)糖摄取:细胞 GLUT2、InsR、PI3K、AKT mRNA表达和GLUT2、IRS1、p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平;3)能量代谢:细胞SIRT1、SIRT3 mRNA 表达和 AMPK、PGC-1α、TFAM、NRF-2、CPT-1、FOX01 和 ACC 蛋白表达水平。结果:(1)4种单体成分的体外安全浓度范围:不同浓度的葛根素、黄芩素、小檗碱和甘草酸对正常HepG2细胞增殖活力均呈现一定的抑制作用,4种单体成分在10-9～10-5mol/L浓度区间体外对HepG2细胞的增殖活性无明显影响(P>0.05)。(2)HepG2 IR细胞模型诱导的方法学考察:体外培养条件下,25mmol/L葡萄糖与10-6mol/L胰岛素联合诱导24h,可以成功复制出稳定可靠的体外HepG2IR模型,该模型可持续48h。(3)4种单体成分体外抗IR的浓度-效应范围:一定浓度区间的葛根素、黄芩素、小檗碱和甘草酸对HepG2细胞的增殖活性均无明显影响(P>0.05),但对IR模型糖利用均有不同程度的促进作用,并呈现出“量-效”关系。葛根素和小檗碱有效浓度范围均为10-9～10-5mol/L,黄芩素和甘草酸有效浓度范围均为10-8～10-5mol/L。(4)4种单体成分体外抗IR活性及效应机制:一定浓度区间的葛根素、黄芩素、小檗碱和甘草酸以及二甲双胍狐对HepG2 IR模型细胞均显著提高葡萄糖消耗量(P<0.05或P<0.01或P<0.001),提高 PK 和 GCK 活性(P<0.05 或P<0.01 或 P<0.001),上调其 InsR、PI3K、AKT、GLUT2 mRNA(P<0.05 或P<0.01)和 IRS-1、p-PI3K、p-AKT、GLUT2 蛋白表达水平(P<0.05或 P<0.01),下调其 G6Pase、PEPCKmRNA 表达水平(P<0.05 或P<0.01)。此外,葛根素、小檗碱以及二甲双胍还涉及上调模型细胞SIRT1、SIRT3 mmRNA表达(P<0.05或P<0.01)和 AMPK、PGC-1 α、TFAM、NRF-2、CPT-1 蛋白表达水平(P<0.05 或P<0.01),下调其FOXO1、ACC蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01)。(5)4种单体成分效阈浓度下不同配伍的抗IR效应及作用机制:1)4种单体成分各自效阈浓度下1/4、1/10和1/100的配伍对HepG2 IR细胞模型的葡萄糖消耗量均有不同程度的改善作用(P<0.05或P<0.01)。2)对4种单体效阈浓度下1/100的几种不同组合配方(A、A+B、A+B+C、A+B+C+D)对HepG2 IR模型细胞葡萄糖消耗量、PK、GCK和GLUT2活性相关指标均有不同程度的改善作用(P<0.05或P<0.01或P<0.001),其中4种单体复合组方(A+B+C+D)的效应最佳。(3)4种单体成分效阈浓度下的1/100和1/10低浓度配方均能显著上调模型细胞 InsR、PI3K、AKT、GLUT2 mRNA 表达(P<0.05 或 P<0.01 或 P<0.001)和 IRS-1、p-PI3K、p-AKT、GLUT2 蛋白表达水平(P<0.05 或 P<O.01),下调其 G6Pase、PEPCK mRNA表达水平(P<0.05或P<0.01);同时,还上调模型细胞SIRT1、SIRT3mRNA表达(P<0.05 或P<0.01)和 AMPK、PGC-1α、TFAM、NRF-2、CPT-1 蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01),下调其FOXO1、ACC蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01)。结论:(1)葛根素、黄岑素、小檗碱和甘草酸4种单体成分抗肝细胞IR的生物活性具有较宽的浓度区间,其中葛根素和小檗碱为10-9～10-5mol/L,黄芩素和甘草酸为10-8～10-5mol/L/。(2)葛根素、黄芩素、小檗碱和甘草酸4种单体成分的抗IR作用涉及改善糖摄取、糖利用功能、抑制糖异生等环节,涉及调控IRS1/PI3K/AKT/GLUT2信号通路;葛根素和小檗碱还涉及调控AMPK/SIRT/PGC-1 α信号通路,提示单体成分的作用也可能涉及多靶点、多环节及多个通路。(3)葛根素、黄芩素、小檗碱和甘草酸4种单体成分效阈下浓度(10-9～10-8mol/L)的10-2(10-10～10-11mol/L)的配伍仍具有一定抗IR活性,其中由4种单体配伍的全方作用最优,表明极低浓度下的各成分之间具有一定的协同增效作用。(4)极低浓度(效阈浓度下的1/100和1/10浓度)的4个单体配方的抗IR作用机制涉及改善糖摄取、糖代谢、能量代谢等环节及对IRS1/PI3K/AKT/GLUT2或/和AMPK/SIRT/PGC-1 α信号通路的调节,表明极低浓度条件下4种单体成分配方的降血糖作用涉及多个环节并有其一定分子基础。本课题基于复杂系统理论对中药复方可能存在的多成分低浓度效应模式及其作用机理进行研究,在细胞水平上再次证实效阈浓度下(微量)的多种单体配方具有显著的生物效应并有其确切的分子作用机制。该研究结果论证中医方剂效用原理中存在“多成分极低浓度-效应”的模式,从新的视角揭示中药复方效应物质基础及其作用机理具有重要的科学意义。