目的：心肌梗死是冠状动脉持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，严重危害人类的健康。心肌梗死后发生心室重构、导致心肌肥大，心肌纤维化，最终形成心力衰竭。多年来虽有许多治疗方法，包括介入、药物治疗、外科手术等等，还包括尝试干细胞移植在内的先进技术，但无法中断心衰的进展，因此寻求更有效更先进的治疗方法已成为一项艰巨的任务。近几年，基因治疗越来越被人们广泛接受，大量文献显示microRNAs(miRNAs)参与调控细胞增殖、分化、凋亡和代谢过程。最近miRNAs与心血管疾病的研究逐渐增多，其中microRNA-214(miR-214)是新发现的因子。近期有研究报道miR-214对心肌有保护作用，但对心肌成纤维细胞的作用机制尚不清楚。当心肌收缩力减弱时，心脏排血量降低，肾血流量随之减低，从而肾素-血管紧张素-醛固酮系统(rein-angiotensin-aldosterone system，RAAS)被激活。RAAS被激活后，血管紧张素（Angiotensin，AngII）分泌增加，刺激成纤维细胞分泌胶原蛋白，使胶原纤维合成增多，促使心肌间质纤维化，发生心室重构。因此本研究采用AngII刺激心肌成纤维细胞（cardiacfibroblasts，CFS），建立心肌成纤维细胞纤维化模型，通过细胞转染miR-214来观察miR-214对AngII刺激CFS纤维化的作用，意图寻找出延缓心室重构，抑制心肌纤维化的有效方法。方法：1心肌成纤维细胞的分离、培养与鉴定取出生1-3天的SD乳大鼠，低温麻醉，取出心室肌组织剪成小块，用胰酶消化法通过差时贴壁分离培养心肌成纤维细胞，用波形蛋白（Vimentin）来鉴定其纯度。2不同浓度不同时间AngII对心肌成纤维细胞的作用取原代心肌成纤维细胞培养，状态良好时，饥饿24小时后，用AngII刺激CFS。实验分正常对照组(normal control)，AngII作用组(AngIIgroup，浓度分别为10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，作用时间为24小时），通过MTT比色法检测各组细胞增殖能力；再取适当浓度，作用不同时间（6h、12h、24h），同样用MTT比色法检测各组细胞增殖能力。3不同浓度AngII诱导后CFS分泌胶原的变化取原代心肌成纤维细胞培养，状态良好时，饥饿24小时后，用AngII刺激CFS。实验分组（同方法2）：正常对照组(normal control)，AngII作用组(AngIIgroup，浓度分别为10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，作用时间为24小时），通过羟脯氨酸测试盒检测各组细胞分泌的胶原含量；再取AngII10-6mo1/L浓度，作用不同时间（6h、12h、24h），同样用羟脯氨酸测试盒检测各组细胞分泌的胶原含量。4Q-PCR法检测不同浓度AngII作用下的心肌成纤维细胞中miR-214的表达取原代心肌成纤维细胞培养，状态良好时，饥饿24小时后，用AngII刺激CFS。实验分组：正常对照组(normal control)，AngII作用组(AngIIgroup，浓度分别为10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，作用时间为24小时），通过实时定量PCR法（real time PCR）测定不同浓度AngII作用后成纤维细胞中miR-214的表达水平。5Q-PCR法检测转染miR-214后，心肌成纤维细胞中miR-214的表达取原代心肌成纤维细胞培养，状态良好时进行细胞转染，实验分为五组（正常对照组、前体组、前体空白对照组、抑制剂组、抑制剂空白对照组，作用时间为24小时），通过实时定量PCR法（real time PCR）测定各组中miR-214的表达水平。6Q-PCR法检测细胞转染miR-214后，再经AngII诱导下的心肌成纤维细胞中COLI、COLIII、TGFβ1、MMP-1、MMP-2、TIMPI-1的mRNA表达取原代心肌成纤维细胞培养，状态良好时进行细胞转染24小时后，进行饥饿处理再给予10-6mol/L AngII刺激，然后提取总RNA。实验分为六组（正常对照组、AngII组、AngII+前体组、AngII+前体空白对照组、AngII+抑制剂组、AngII+抑制剂空白对照组），通过实时定量PCR法（realtime PCR）测定各组中COLI、COLIII、TGFβ1、MMP-1、MMP-2、TIMPI-1的mRNA表达水平。7Western法检测细胞转染miR-214后，再经AngII诱导下的心肌成纤维细胞中COLI、COLIII、MMP-1、MMP-2和TGFβ1蛋白表达取原代心肌成纤维细胞培养，状态良好时进行细胞转染24小时后，进行饥饿处理再给予10-6mol/L AngII刺激，然后提取总蛋白。实验分为六组（正常对照组、AngII组、AngII+前体组、AngII+前体空白对照组、AngII+抑制剂组、AngII+抑制剂空白对照组），通过Western法检测定各组中COLI、COLIII、MMP-1、MMP-2、TGFβ1、的蛋白表达。结果：1心肌成纤维细胞培养及鉴定心肌成纤维细胞总体呈‘S’型趋势生长，2~4天处于对数生长期，第4天之后进入平台期。光镜下呈三角形，梭行或多边形；免疫组化结果显示vimentin阳性部位可见棕黄色细丝状或点状细密颗粒（Vimentin）存在于细胞胞浆中，分布较均匀，纯度达95%。2AngII对心肌成纤维细胞活力的影响MTT检测结果提示，心肌成纤维细胞增殖能力随着AngII浓度的升高，作用时间的延长而逐渐增强，呈明显的剂量和时间依赖性。我们选取引起细胞增殖约50%左右的AngII浓度（10-6mol/L）作用24h，建立心肌成纤维细胞纤维化模型。3AngII对CFS分泌胶原的影响羟脯氨酸测试盒检测结果提示，经AngII干预后，与正常对照组相比，AngII（10-8、10-7、10-6、10-5mol/L）组的羟脯氨酸含量随AngII浓度的升高作用时间的延长呈上升趋势，说明心肌成纤维细胞分泌的胶原蛋白随AngII浓度的升高作用时间的延长而增多。4不同浓度AngII作用对心肌成纤维细胞中miR-214表达的影响q-PCR检测显示，与正常对照组相比，AngII组miR-214的表达水平显著下降，且随AngII浓度的升高逐渐下降。5经miR-214转染后心肌成纤维细胞miR-214的表达q-PCR检测显示，转入前体组的miR-214表达水平明显高于前体空白对照组，而转入抑制剂组的miR-214表达水平明显低于抑制剂空白对照组，正常对照组与前体空白对照组、抑制剂空白对照组相比无差异，说明转染成功。6miR-214对AngII干预下的心肌成纤维细胞中COLI、COLIII、TGFβ1、MMP-1、MMP-2、TIMPI-1的mRNA表达的影响q-PCR检测显示:AngII组中CFS的COLI、COLIII、TGFβ1、TIMPI-1mRNA表达水平明显高于正常对照组（P<0.01）；AngII+前体组CFS中COLI、COLIII、TGFβ1、TIMPI-1mRNA表达水平明显低于AngII组（P<0.01），而与正常对照组相比无统计学差异（P>0.05）。在AngII+抑制剂组COLI、COLIII、TGFβ1、TIMPI-1mRNA表达水平显著高于AngII组（P<0.05）。AngII+前体空白对照组、AngII+抑制剂空白对照组COLI、COLIII、TGFβ1、TIMPI-1mRNA表达水平与AngII组相比无统计学差异（P>0.05）。AngII组中CFS的MMP-1、MMP-2mRNA表达水平明显低于正常对照组（P<0.05）；AngII+前体组中MMP-1、MMP-2mRNA表达水平明显高于AngII组（P<0.01），而与正常对照组相比无统计学差异（P>0.05）。在AngII+抑制剂组MMP-1、MMP-2mRNA表达水平显著低于AngII组（P<0.01）。AngII+前体空白对照组、AngII+抑制剂空白对照组MMP-1、MMP-2mRNA表达水平与AngII组相比无统计学差异（P>0.05）。7miR-214对AngII干预下的心肌成纤维细胞中COLI、COLIII、MMP-1、MMP-2和TGFβ1蛋白表达的影响Western-blot法检测显示:AngII组中CFS的COLI、COLIII、TGFβ1蛋白表达水平明显高于正常细胞组（P<0.05）；AngII+前体组CFS中COLI、COLIII、TGFβ1蛋白表达水平明显低于AngII组（P<0.05），而COLI、COLIII蛋白表达水平与正常对照组相比无统计学差异（P>0.05），TGFβ1蛋白表达水平稍高于AngII组（P<0.05）。在AngII+抑制剂组COLI、COLIII、TGFβ1蛋白表达水平显著高于AngII组（P<0.05）。AngII+前体空白对照组、AngII+抑制剂空白对照组COLI、COLIII、TGFβ1蛋白表达水平与AngII组相比无统计学差异（P>0.05）。AngII组中CFS的MMP-1、MMP-2蛋白表达水平明显低于正常对照组（P<0.01）；AngII+前体组中MMP-1、MMP-2蛋白表达水平明显高于AngII组（P<0.05），而与正常对照组相比无统计学差异（P>0.05）。在AngII+抑制剂组MMP-1、MMP-2蛋白表达水平显著低于AngII组（P<0.05）。AngII+前体空白对照组、AngII+抑制剂空白对照组MMP-1蛋白表达水平稍低于AngII组（P<0.05）。AngII+前体空白对照组、AngII+抑制剂空白对照组MMP-2蛋白表达水平与AngII组相比无统计学差异（P>0.05）。结论：1AngII刺激心肌成纤维细胞产生胶原蛋白，并且呈浓度和时间依赖性。AngII(10-6mol/L)作用心肌成纤维细胞24h可使活力提升50%左右。2在心肌成纤维细胞中，miR-214的表达随AngII浓度的升高而成下降趋势，miR-214过表达可以抑制胶原蛋白I、III的分泌，说明miR-214与纤维化有关。3miR-214可通过抑制促纤维化因子TGF-β1表达，抑制TIMP1的合成，从而促进MMP-1和MMP-2表达，抑制胶原蛋白的产生，达到抑制纤维化的目的。