【摘 要】
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实验目的:探讨达格列净（Dapagliflonzin,Dapa）下调高糖高脂（High glucose/High Palmitic acid,HG/PA）诱导的人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）自噬、改善内皮紊乱的重要作用及潜在分子机制。材料与方法:1、收集主动脉夹层（Aortic dissection,AD）手术病人的胸
【基金项目】
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湖南省自然科学基金（面上项目）,2019JJ40262,达格列净对糖尿病大鼠大血管自噬及LKB1/AMPK/mTOR信号通路的影响湖南省研究生科研创新项目,CX20190771,达格列净通过Sonic Hedgehog信号通路调控自噬改善糖尿病大鼠大血管病变；
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实验目的:探讨达格列净（Dapagliflonzin,Dapa）下调高糖高脂（High glucose/High Palmitic acid,HG/PA）诱导的人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）自噬、改善内皮紊乱的重要作用及潜在分子机制。材料与方法:1、收集主动脉夹层（Aortic dissection,AD）手术病人的胸主动脉组织标本,通过免疫组化及免疫荧光检测SGLT-2的表达情况;2、采用过表达质粒SLC5A2转染HUVECs,过表达SGLT-2蛋白,检测过表达SGLT-2后HUVECs自噬及细胞功能变化;3、采用自噬抑制剂3-MA（5m M）预处理过表达SGLT-2的HUVECs,通过观察内皮功能变化情况,明确SGLT-2诱导的自噬与内皮细胞功能紊乱之间的关系;4、以HUVECs作为体外实验对象。不同处理因素（葡萄糖/棕榈酸:11m M/0.125m M,22m M/0.25m M,33m M/0.5m M,44m M/1.0m M,55m M/2.0m M;达格列净:1μM/2μM/5μM/10μM）,分别刺激细胞24小时,CCK-8检测HUVECs增殖情况,筛选最佳实验诱导组及药物作用组;5、将实验分为:正常组（5.5m M葡萄糖）、对照组（16.5m M甘露醇+10%牛血清白蛋白+0.1M氢氧化钠）、HG/PA组（22m M葡萄糖,0.125m M棕榈酸）、HG/PA+Dapa（5μM）组。利用免疫印记及免疫荧光技术对HUVECs上的SGLT-2蛋白表达进行检测,了解SGLT-2蛋白的变化情况;此外,我们采用细胞增殖、迁移、成管以及凋亡等方法来评估内皮细胞功能;运用免疫印记、电镜下检测自噬小体数目等方法来评估内皮细胞自噬水平。结果:1、在人胸主动脉组织及HUVECs内存在SGLT-2的表达,免疫组化、免疫荧光及免疫印迹显示,SGLT-2在动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）的人胸主动脉组织及HG/PA诱导的HUVECs中表达稍有上调;2、在HUVECs中过表达SGLT-2后,可上调自噬蛋白LC3-II、Beclin1、ATG5,下调P62,抑制HUVECs增殖、迁移、成管能力,增加细胞凋亡,上调凋亡相关蛋白（P<0.05）;3、加入自噬通路抑制剂3-MA（5m M）预处理后,恢复了过表达SGLT-2诱导的迁移及成管功能紊乱（P<0.05）,改善了细胞凋亡（P<0.05）;4、利用不同浓度HG/PA（11/0.125、22/0.25、33/0.5、44/1.0和55/2.0 m M）刺激HUVECs 24小时,HG/PA浓度依赖性的减少了HUVECs增殖（P<0.05）,同时抑制了HUVECs的迁移,降低了HUVECs的成管,Hoechst荧光斑点显著增加,增加了凋亡蛋白Caspase-3、Bax含量,下调了Bcl 2（P<0.05）;加入最佳处理浓度SGLT-2抑制剂（Sodium-glucose co-transporters 2 Inhibitor,SGLT-2i）达格列净（5μM）改善了HG/PA抑制的HUVECs增殖（P<0.05）,显著恢复了HG/PA抑制的细胞成管、迁移能力,Hoechst荧光斑点减少,Caspase-3、Bax蛋白表达下调,Bcl 2蛋白表达升高（P<0.05）;5、HG/PA（22/0.25 m M）刺激HUVECs24小时后自噬蛋白LC3-II、Beclin1、ATG5、P62及自噬小体含量显著增加（P<0.05）,加入达格列净后明显减少了HG/PA诱导的HUVECs的自噬蛋白及自噬小体数目的增加（P<0.05）。结论:1、在病变的人胸主动脉组织及HUVECs内均存在SGLT-2的表达,且SGLT-2在AS的人胸主动脉组织及HG/PA诱导的HUVECs中表达上调;2、达格列净通过靶向SGLT-2,下调HG/PA诱导的HUVECs自噬,减少HUVECs凋亡,改善HUVECs功能紊乱。
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