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内生真菌物种丰富且数量庞大,而且与其它生物之间具有紧密的生态关系,同时也是天然活性物质的潜在来源。近年来,植物内生真菌引起人们的广泛关注,成为目前国内外研究的热点之一。相对于其他植物内生真菌的研究情况,茶树作为重要的经济作物,其内生真菌的研究起步相对较晚。本研究以茶树无性系品种龙井茶叶为材料,结合对真菌ITS区段的分子鉴定,首次对茶树内生真菌在不同生境、不同季节和不同的分离部位的种类与多样性进行了较为系统的研究,并分离鉴定出3个真菌新种与1个茶树内生真菌的新记录种。得到了茶树内生真菌16属21种的ITS完整序列,并对茶树内生真菌的泌酸性进行了初步的分析。主要研究成果如下:
⑴对内生真菌的分离方法进行了研究,结果表明:仅使用酒精并不能对用于进行内生真菌分离的样品完成表面消毒,而传统使用升汞的灭菌方法的污染率控制很好,内生真菌的分离能够达到较好的效果。浓度为1.5%次氯酸钠溶液是升汞的较好替代品,在1.5%次氯酸钠溶液中,叶片浸泡3 min,茎段浸泡8 min即可达到较好的消毒效果。实验中所采用的样本接种方法对真菌可分离种类和数量不存在显著影响,但切口与培养基接触面积大的接种方式能够使菌落生长更开展,从而有利于实验的后续进行。
⑵本研究中分离得到的Melanconia sp.和Pleosporales sp.由于与其他已知真菌在ITS区段上存在较大差距,可能是与茶树协同进化的专性内生真菌种类,在这里鉴定为新种。长盘孢属真菌Glomerella sp.经鉴定与已知长盘孢属其他真菌ITS区段差别在3%以上,也可以鉴定为新种。而座坚壳属真菌Rosellinia sp.则在茶树内生真菌中属首次分离得到。
⑶茶树内生真菌的最大优势种为茎点霉属Phoma真菌茶茎点霉Phomopsis sp4.,其次为盘长孢属Gloeosporium的茶盘孢菌Glomerella sp.。此外脉孢菌属Neurospora的粗壮脉纹胞菌Neurospora crassa和盘长孢属Gloeosporium的胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides也是茶树的优势内生真菌种。而假尾孢属Pseudocercospora的柿假尾孢Pseudocercospora kaki,拟茎点霉属Phomopsis的Phomopsis sp1.和Phomopsis sp3.则为茶树内生真菌中的偶然种。
⑷林下茶园相对于非林下茶园有着更好的物种多样性和更加良好的物种丰富度。但两者的均匀度指数相近,两者的种群也处于极高相似度水平。
⑸在春季叶片和茎段的物种多样性均好于冬季和秋季,冬季则略好于秋季,这一差别在茎段中更为明显。叶片普遍比茎段有着更好的物种多样性,但是这也不排除茎段中部分优势种在培养基中的长势过快,从而抑制了某些长势弱的真菌,导致了分离到的真菌种类偏少的结果。从均匀度指数来看,叶片和茎段在冬季均有较高的均匀度,而春季次之,秋季最低。各个季节内,叶片的均匀度指数均略高于茎段。
⑹春茶采摘时期,茶树茎、芽、叶中的内生真菌群落相似性较低,可能与内生真菌的定植和转移分别发生在不同的季节有关。
⑺不同的内生真菌在茶树的各部位存在一定的组织专化性。茶树内生芒果球座菌Guignardia mangiferae、绿色木霉Trichoderma viride、菌核青霉Penicilliumsclerotiorum和新发现种Pleosporales sp.在叶片中表现出较强的偏好性,而茶茎点霉Phomopsis sp4.、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、棒形拟盘多毛孢Pestalotiopsis clavispora、茶盘孢菌Glomerella sp.和粗壮脉纹胞菌Neurosporacrassa则表现出较强的茎段偏好性。
⑻不同的内生真菌对PDA液态培养基的pH值有不同的影响。但大多数真菌在培养的过程中会加重培养基的酸化,导致酸化最为严重的真菌菌株JF07和JF02属于新种Melanconia sp.,YZ01和YZ02则是菌核青霉Penicillium sclerotiorum。相对与CK而言能够较大提高pH值的几个菌株分别是胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides的菌株JF04,Phomopsis sp2.的菌株EF3和EF6,尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum的菌株JZ02,球毛壳菌Chaetomium globosum的菌株EF9,串珠状赤霉Gibberella moniliformis的菌株ZH01,以及围小从壳菌Glomerellacingulata的菌株EF5。