荧光探针是可视化检测生物体内活性分子的手段之一,因其具有高灵敏性、高选择性和良好的生物相容性,被广泛地应用于蛋白、核酸、酶、生物活性小分子的体内外检测。本论文基于硝酰基与水解酶在体内重要的生理作用,开展了硝酰基、脂肪酶、甘油二酯脂肪酶荧光探针的研究,研究内容主要包括以下三部分:第一部分:一种用于活细胞中硝酰基成像的快速响应型近红外荧光探针硝酰基（Nitroxyl,HNO）是一氧化氮的单电子还原产物,在生理过程中发挥着独特的生物学功能。HNO在治疗心力衰竭、酒精中毒和预防红外线损伤等方面具有重要的作用。但由于HNO在体内存在时间很短且缺少快速检测的工具,所以目前仍不清楚内源性HNO的合成途径和生理作用机制。本研究选用2-（二苯基膦基）苯甲酸作为HNO的识别基团和CP-OH作为近红外荧光团,设计合成了一种用于检测HNO的荧光探针CPN。CP-OH的羟基与2-（二苯基膦基）苯甲酸反应形成酯键,抑制了分子内电荷转移效应,淬灭了CPN的荧光。当探针CPN与HNO作用时,CPN的酯键被破坏,释放出荧光团CP-OH,在近红外区（670 nm）发出强烈的荧光。体内外性能评价表明探针CPN能快速检测体内外HNO,检测限达到1.0×10-6 M,这对于监测短暂存在于生物系统中的HNO的动态变化非常重要。因此,探针CPN在研究HNO在生物系统中的作用等方面有很大的潜力。第二部分:一种用于检测人血清中脂肪酶活性的比率型荧光探针急性胰腺炎是一种常见的胃肠道疾病,发病率高,死亡率高。血清脂肪酶主要来源于胰腺,是诊断急性胰腺炎的重要生物标志物之一,其灵敏性和准确度要远高于血清淀粉酶。血清脂肪酶活性的检测对于急性胰腺炎早期诊断具有重要意义。然而,目前仅开发出几款在两相溶液中检测脂肪酶活性的单荧光发射的荧光探针,上述探针检测结果的准确性易受环境的影响。因此,迫切需要开发一款具有自我校正特性的环境友好型荧光探针用于检测脂肪酶活性。为此,本研究根据脂肪酶对酯键的水解特性,设计合成了一种用于检测脂肪酶活性的比率荧光探针（CARA）。通过以丙氨酸为核心,丙氨酸的氨基与香豆素酸的羧基以酰胺键连接形成能量供体（CA）,CA的羧基通过酯键与能量受体罗丹明醇（RA）的羟基连接,构建了荧光共振能量转移（Fluorescent Resonance Energy Transfer,FRET）体系。当探针CARA与脂肪酶作用时,由于探针CARA的酯键被脂肪酶水解,改变了CA与RA间的FRET过程,导致荧光信号的改变,从而检测脂肪酶活性。体外评价表明在人血清和水溶液中,CARA探针对脂肪酶有较好的选择性和抗干扰能力,在PBS溶液和HS/PBS溶液中的检出限分别为48.5 U/L和69.88 U/L。因此,探针CARA在急性胰腺炎的早期临床诊断中具有潜在的应用价值。第三部分:基于天然底物的比率型荧光探针用于甘油二酯脂肪酶活性的检测甘油二酯脂肪酶（Diacylglycerol lipase,DAGL）是内源性大麻素2-花生四烯酸甘油酯（2-arachidonoylglycerol,2-AG）的生物合成关键酶。它通过调节2-AG的水平参与中枢神经系统的多种生理活动。据报道,DAGL与癫痫、焦虑、抑郁、恐惧等神经精神疾病密切相关。但因缺少原位检测DAGL活性的工具,所以DAGL在各种神经精神疾病下的活性动态尚不清楚。本研究根据DAGL的催化底物甘油二酯的分子结构,以及DAGL特异性水解甘油二酯1-位酯键的特性,设计合成了一种用于特异性检测DAGL活性的荧光探针（DCR）。该探针以丙三醇为核心,通过酯键将荧光团香豆素酸（CR）和罗丹明衍生物（LR）连接到丙三醇的1、2号位,在两个荧光团间建立FRET体系。当探针DCR与DAGL作用时,由于探针1-位酯键的水解破坏了FRET体系,引起两荧光团间FRET信号的变化,达到检测DAGL活性的目的。体内外性能评价表明探针DCR对DAGL有很好的选择性,能够应用于组织与活体内DAGL活性的可视化检测。