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银杏是我国特有的珍稀名贵树种,素有“植物界的活化石”之称,被列为国家二级保护植物。我国的银杏叶资源占世界总量的70%,居世界第一位。国内外对银杏叶有效成分的研究和报道较多,主要集中在银杏黄酮和内酯。银杏酸(Ginkgolic Acids,简称GA)是银杏中除黄酮和内酯外又一具有重要生理活性的组分,主要存在于银杏的叶(占干重的1-2%)、果和外种皮(占干重的3-5%)中,尤以银杏果外种皮中含量最高。银杏酸为水杨酸的6-烷基或6-烯基衍生物,其苯环六位上的侧链碳原子数为13~19,侧链双键数为0-3。它主要由白果新酸(ginkgonelic acid)、白果酸(ginkgolic acid)、氢化白果酸(hydroginkgolic acid)、氢化白果亚酸(hydroginkgolinic acid)、白果二酚(bilobols)等组成。现代毒理学研究表明,银杏酸具有致敏性、胚胎毒性、免疫毒性和细胞毒性等生物毒性,被认为是银杏叶提取物(EGB)中最主要的毒副作用成分。因此,银杏酸含量被作为国内外银杏叶提取物制剂的重要质量控制指标。国外从20世纪60年代起就对银杏酸进行了研究。欧美日和中国的国家药典均把银杏酸作为银杏叶提取物和制剂的限量要求列入质量标准,例如欧洲药典、美国药典要求银杏酚酸含量(质量分数)控制在5ppm以下,有的企业内部标准甚至要求低于1ppm;《中国药典》2010年版中也将银杏酸限度定为10ppm。因此,对银杏酸类成分进行深入研究,显得尤为重要。本课题对银杏酸成分开展了如下研究:A、银杏酸单体分离目的:从银杏外种皮中制备分离银杏酸单体方法:以银杏外种皮为原料,粉碎后加4倍量石油醚(30-60℃)回流提取2次,每次2小时,合并提取液,浓缩,得银杏酸粗提物。银杏酸粗提物经小孔吸附树脂纯化,去除部分色素杂质;再经反相中压制备柱分离富集,得到流分Ⅰ(主要含银杏酸C13:0和C15:1,少量C17:2)和流分Ⅱ(主要含银杏酸C17:1和少量C15:0)。流分Ⅰ经乙腈-水系统多次重结晶,富集银杏酸单体C13:0,其重结晶后母液中主要为银杏酸C15:1。结晶用甲醇溶解,采用制备液相,以甲醇-水系统为流动相,进行分离纯化,制得银杏酸单体C13:0(白果新酸);母液同样采用制备液相、甲醇-水系统分离纯化,制得银杏酸单体C15:1、C17:2。流分Ⅱ经制备液相甲醇-水系统多级分离,制得银杏酸单体C17:1和C15:0。结果:从1kg粉碎后的银杏外种皮中制得银杏酸单体C13:04.98g,C15:111.5g,C17:10.45g,C15:00.87g,C17:29.29g。经HPLC-DAD检测和HPLC-MS、1H-NMR和13C-NMR分析,证实制备所得银杏酸单体为C13:0、C15:1、C17:2、C17:1及C15:0,其纯度均大于98%。结论:银杏酸外种皮通过石油醚回流提取、小孔吸附树脂去色素、中压制备柱粗分和制备液相纯化,可大量制备纯度大于98%的银杏酸单体成分,解决了银杏酸定量测定时对照品缺失或对照品纯度低的难题,为后续新的分析方法的建立奠定了基础。B、银杏酸定量分析方法的建立及在银杏叶提取物生产过程质量控制中的应用目的:建立新的更科学、准确的银杏叶提取物中银杏酸限度的检查方法,并将其应用到银杏叶提取物大生产制备过程,指导除酸工艺,制备低酸银杏叶提取物。方法:银杏叶提取物以甲醇超声提取,制备供试品溶液;色谱分析条件:色谱柱为Agilent C18,流动相为乙腈-0.1‰三氟乙酸水梯度洗脱;流速1mL.min-1;检测波长210nm;以自制银杏酸单体为对照,建立新的银杏酸限度检查方法。在银杏叶提取物大生产制备过程中,应用新建的银杏酸分析方法,优化银杏叶提取物生产关键工序的参数。结果:本研究建立的银杏叶提取物中银杏酸限度检查方法,线性关系良好,回收率分别为99.4%、99.7%、98.6%、98.0%和98.8%,(RSD<2.0%)。银杏叶提取物制备过程中,水沉时的密度和时间、树脂除酸过程中乙醇浓度和洗脱体积是影响中间体银杏酸含量的主要因素。结论:本研究建立的银杏酸限度检测方法,供试品前处理方法简便、快捷,测定结果准确,可用于低酸银杏叶提取物的限度检查。同时,以该法作为大生产低酸银杏叶提取物制备的中间体质量控制方法,指导低酸生产工艺,可以保证制备出低酸银杏叶提取物。