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研究背景:
当前，对蜘蛛毒素的生物功能及其作为药物先导分子在药理学研究中应用的探索，越来越受到天然药物开发研究者的重视。但是，天然毒液的产量较小这一问题，一直制约着其功能和活性的研究进展。为此，探索合成或者生产蜘蛛毒素的简便易行的方法，已经是当前该领域研究者亟待解决的问题。虎纹捕鸟蛛（Ornithoctonus huwena）是分布在华南山区的一种体型较大的毒蜘蛛。目前已从其毒液中分离出多种蛋白质和多肽，并且已经鉴定部分蛋白质和多肽的生物活性。其中，多肽DkTx(double-knot toxin)可以通过刺激细胞膜外侧孔区域激活辣椒素受体和瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）通道，促进降钙素相关肽的释放，进而起到舒血管及降血压的作用。森林漏斗蛛(Agelena silvatica)是漏斗蛛科蜘蛛中，毒液毒性较小的蜘蛛，广泛分布在我国南北方的山林和草原地区，其可利用毒液麻痹昆虫进行捕食。目前，国内尚没有对该种蜘蛛的毒素研究，缺乏相关的数据，本研究将填补这些数据的空白。
研究目的:
1、筛选DkTx的类似物，并进行功能分析。
2、构建森林漏斗蛛毒腺的cDNA文库，筛选新的毒素基因。
研究方法:
1、设计引物，在虎纹捕鸟蛛毒腺cDNA文库中，通过PCR扩增出目的基因。将目的基因构建至表达载体pVT102U/α，利用酿酒酵母S-78株进行表达，并将表达产物分离纯化、鉴定。
2、取森林漏斗蛛毒腺，利用CreatorTM SMARTTM cDNA LibraryConstruction Kit构建cDNA文库，设计引物，通过PCR扩增筛选新的毒素基因。
研究结果
1、在虎纹捕鸟蛛毒腺的cDNA文库中，成功筛选出4种DkTx类似物: FR+T3F34+P-5、 FR+T3F34+P-6、 FR+T5R32+P-8、FR+T5R32+P-105。并通过酿酒酵母S-78株表达了DkTx类似物，其中FR+T5R32+P-8的氨基酸序列得以正确表达。
2、通过构建cDNA文库，筛选出5种cDNA序列:D7、D82、D134、D523、D787。其中D7、D134、D523、D787为新的蜘蛛毒素基因;D82与Agelenopsis aperta的蜘蛛毒素Toxin_7超家族的序列完全相同。
结论:
1、成功筛选了4种DkTx的类似物，并通过酿酒酵母表达。
2、通过构建森林漏斗蛛cDNA文库，成功克隆出4种新的毒素基因。