nr2f2又名coup-tfII，是核受体家族的重要成员，其对哺乳动物早期性别分化、雄性Leidig细胞发育以及雌性育性的维持具有重要作用。目前，尚无nr2f2与鱼类生殖发育相关的报道。在本研究中，我们从尼罗罗非鱼基因组中分离了两个nr2f2基因，命名为nr2f2a和nr2f2b。分析了nr2f2a和nr2f2b在尼罗罗非鱼各组织中的表达和性腺中的细胞定位，并通过特异性抑制剂和基因敲除初步探究了它们在罗非鱼生殖中的功能。主要结果如下：
　　(1)尼罗罗非鱼nr2f2s的分离及克隆。基于尼罗罗非鱼基因组和性腺转录组，分离得到两个nr2f2基因，命名为nr2f2a和nr2f2b。通过设计特异性引物，对nr2f2a和nr2f2b的ORF进行了克隆。nr2f2a的ORF全长1254bp，编码417个氨基酸；nr2f2b的ORF全长1299bp，编码432个氨基酸。氨基酸序列分析发现，同其它脊椎动物的Nr2f2一样，尼罗罗非鱼Nr2f2a和Nr2f2b具有高度保守的DNA结合结构域(DBD)和配体结合结构域(LBD)。
　　(2)脊椎动物nr2f2的系统进化及共线性分析。通过NCBI和Ensembl分离了脊椎动物的nr2f2基因，构建了系统进化树。系统进化分析结果表明，nr2f2b产生于真骨鱼类特有的第三轮基因组复制，但在某些基部类群如鲤形目和鲇形目中发生了次生性丢失。共线性分析证实了nr2f2在真骨鱼中的复制和nr2f2b的次生性丢失。
　　(3)nr2f2a和nr2f2b在尼罗罗非鱼成鱼各组织和性腺发育各时期的表达。RT-PCR和Real-timePCR结果表明，nr2f2a表达于孵化后300天罗非鱼成鱼的脑、垂体、心脏、脾脏、卵巢、精巢和肾脏中；nr2f2b主要表达于脑和卵巢中。尼罗罗非鱼性腺转录组分析结果显示，nr2f2a在孵化后5、30、90、180、300天的精巢表达高于卵巢，nr2f2b主要在孵化后300天的卵巢中表达，且表达低于nr2f2a。
　　(4)nr2f2a和nr2f2b在尼罗罗非鱼性腺中的细胞定位。原位杂交结果显示，nr2f2a主要表达于罗非鱼精巢中除精细胞以外的其它细胞和卵巢I、II时相卵母细胞；nr2f2b表达于卵巢I、II时相卵母细胞，与nr2f2a在卵巢中表达位置相同，nr2f2b在精巢中不表达。通过制备的特异性抗体，我们对Nr2f2a在性腺中的表达进行了验证。免疫荧光结果与原位杂交结果一致。
　　(5)抑制剂处理。利用nr2f2的特异性抑制剂从孵化后第10天开始对野生型XX和XY尼罗罗非鱼进行处理(5μM/g)，处理到孵化后240天后，对处理鱼性腺表型进行分析。结果显示，与对照组相比，处理雄鱼精巢结构紊乱，生殖细胞减少，处理雌鱼卵巢存在卵母细胞退化，表明nr2f2对尼罗罗非鱼配子发生具有重要作用。
　　(6)nr2f2a和nr2f2b的突变研究。通过CRISPR/Cas9对尼罗罗非鱼nr2f2a和nr2f2b进行了突变。对杂合突变体进行分析发现，nr2f2a和nr2f2b杂合突变雄鱼均能产生正常可育精子，nr2f2a杂合突变雌鱼能够产卵但卵子质量下降，卵子可以受精但胚胎发育致死；nr2f2b杂合雌鱼卵子受精后除少数胚胎发育畸形以外，多数能正常存活。这些结果表明，nr2f2a和nr2f2b对尼罗罗非鱼卵子发生和卵子质量具有重要作用。nr2f2s在尼罗罗非鱼生殖中的作用仍需进一步研究。
　　综上所述，我们从尼罗罗非鱼中分离了两个nr2f2基因，nr2f2a和nr2f2b。nr2f2a为四足动物nr2f2的直系同源基因，nr2f2b产生于真骨鱼类特有的全基因组复制并在鲤形目和鲇形目等进化基部的鱼类中发生了次生性丢失。表达和功能分析结果显示nr2f2a和nr2f2b对尼罗罗非鱼配子发生具有重要作用。本研究为尼罗罗非鱼配子发生的研究提供了新的候选基因，有助于深化我们对nr2f2在脊椎动物生殖中的作用的理解。同时，本研究对于提高卵子质量，增加罗非鱼产量，缓解人口增长带来的粮食危机具有重要意义。