【研究背景与目的】肝癌发病隐匿,且具有高复发易转移的特点,现阶段临床治疗手段仍然局限。最新的全球数据统计显示,肝癌是癌症相关死亡的第四大常见原因,肝癌的五年生存率仅为18%,是仅次于胰腺癌的第二大致命性肿瘤。根据组织学分型,原发性肝癌可分为肝细胞肝癌、胆管细胞肝癌及混合型肝癌,其中肝细胞肝癌约占原发性肝癌的90%。临床资料显示,大多数肝细胞肝癌发生在患有基础肝病的患者中,主要是由于乙型、丙型肝炎病毒感染或酗酒等原因,随着非酒精性脂肪肝疾病连同代谢综合征和肥胖症的增加,也加剧了肝细胞肝癌的发病风险。肝癌转移普遍被认为是肝癌患者晚期常见的临床症状,也是导致肝癌患者死亡的主要原因之一。近些年的研究有别于传统的转移理论,认为肿瘤转移在肿瘤的早期阶段即可发生,不仅局限于肿瘤边缘,也可发生于肿瘤的核心区域。肿瘤在演进过程中,能够通过释放细胞外囊泡率先影响原位微环境和靶器官微环境,从而在特定位点形成有利于肿瘤转移的转移龛。肿瘤转移并非是一个随机的过程,肿瘤细胞衍生的细胞外囊泡能够激活一系列分子程序,造成局部的免疫抑制、炎性反应、血管生成及通透性增强、淋巴管生成等,并能够优先寻找特定器官并重编程。外泌体作为细胞外囊泡之一,是一种细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列精密调控过程而形成的由脂质双分子膜包裹的纳米级小囊泡,直径约为50-150nm。外泌体通常由一系列的生物分子组成,包括蛋白质、短链多肽、脂类、DNA的碎片、m RNA、micro RNA等。外泌体的组成成分与分泌细胞的病理生理状态密切相关,在细胞间物质和信息转导中发挥着重要的作用。就肿瘤细胞而言,其释放外泌体的水平要显著增加,且外泌体的组成成分较正常细胞也有所不同,这不仅反应了肿瘤细胞对外泌体结构和功能的精密调控,也暗示了肿瘤外泌体在肿瘤发生发展过程中具有重要意义。作为肿瘤微环境中的重要成员之一,近年的多项研究也证实肿瘤外泌体参与了肿瘤微环境间的信号转导及肿瘤形成和恶化等重要生物过程。蛋白质作为生理功能的执行者,其可变性和多样性等特殊性质影响着整个生命活动进程。众多蛋白质组学研究证实,正常肝细胞与不同肝癌细胞之间蛋白质表达谱差异显著,不同差异蛋白的生物学功能及其参与肝癌发生发展的相关机制相继得到阐明,肝癌蛋白质图谱的绘制越发清晰。然而,不同肝癌细胞衍生的外泌体中蛋白质表达是否存在差异,内含的差异蛋白质是否参与调控肝癌恶性进展的相关研究却相对匮乏。基于此,本研究旨在不同肝癌细胞转移潜能具有异质性的基础上,明确高转移性肝癌细胞外泌体对低转移肝癌细胞的教化作用,通过比较高转移性肝癌细胞、低转移性肝癌细胞及正常肝细胞的外泌体蛋白质表达谱差异,进一步明确高转移性肝癌细胞外泌体介导的相关蛋白对肝癌生长和转移的影响,探索其促进肝癌恶性进展的相关分子机制,为深入理解肝癌恶化过程,以改善肝癌的临床诊断和治疗提供新思路。【研究内容与方法】1.选取同一患者来源的具有不同肺转移发生率的MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3肝癌细胞株,通过体外细胞功能实验比较3种肝癌细胞增殖、迁移侵袭能力和上皮间质转化情况,明确高低转移性肝癌细胞。2.利用超速离心法提取高转移性肝癌细胞衍生的外泌体,通过蛋白免疫印迹、透射电镜和纳米颗粒跟踪分析进行鉴定,并通过细胞膜染色试剂盒(PKH67)进行外泌体示踪观察低转移肝癌细胞对高转移性肝癌细胞衍生的外泌体的摄取情况。3.利用高转移性肝癌细胞衍生的外泌体处理低转移肝癌细胞,通过CCK-8、Transwell、蛋白免疫印迹等体外实验检测高转移性肝癌细胞衍生的外泌体对低转移肝癌细胞增殖、迁移侵袭能力和上皮间质转化的影响。4.利用高转移性肝癌细胞衍生的外泌体处理低转移肝癌细胞,通过肝原位注射和尾静脉注射裸鼠模型检测高转移性肝癌细胞衍生的外泌体对低转移肝癌细胞肝内成瘤和肺转移的影响。5.提取正常肝细胞和不同转移潜能肝癌细胞的外泌体,进行TMT标记的定量蛋白质组学分析,分析外泌体蛋白表达差异并结合数据库筛选高转移性肝癌细胞衍生的外泌体中可能参与教化低转移性肝癌细胞恶性转变,促进肝癌恶性进展的关键蛋白。6.明确外泌体中ENO1的表达差异是否是由于细胞水平的表达差异引起的假设,通过蛋白免疫印迹、免疫组化染色实验检测ENO1在肝癌细胞水平和肝癌组织水平的表达,并统计分析ENO1的表达与肝癌患者临床病理特征的相关性。7.利用慢病毒载体构建稳定敲降及过表达ENO1的肝癌细胞株,提取稳定敲降及过表达ENO1肝癌细胞的外泌体并进行鉴定及示踪,检测稳转细胞衍生的外泌体中ENO1表达水平,并观察调控细胞中ENO1表达对其外泌体分泌和摄取的影响。8.通过CCK-8、Transwell、蛋白免疫印迹等体外实验检测敲降及过表达ENO1对肝癌细胞增殖、迁移侵袭能力及上皮间质转化的影响,同时检测外泌体介导的ENO1对低表达ENO1肝癌细胞增殖、迁移侵袭能力及上皮间质转化的影响。9.利用尾静脉注射裸鼠模型检测敲降及过表达ENO1对肝癌细胞肺转移的影响,同时检测外泌体介导的ENO1对低表达ENO1肝癌细胞肺转移的影响。10.检索文献、数据库结合生物信息学分析预测ENO1调控的下游蛋白和相关信号通路,通过蛋白免疫印迹、免疫荧光等实验验证敲降及过表达ENO1以及外泌体介导的ENO1对下游蛋白和相关信号分子的影响。【研究结果】1.与肝癌细胞MHCC97L、MHCC97H相比,肝癌细胞HCCLM3具有更强的增殖和迁移侵袭能力且细胞发生上皮间质转化,更具高转移性。2.高转移性肝癌细胞HCCLM3衍生的外泌体能够促进低转移肝癌细胞MHCC97L和Hep G2的增殖、迁移侵袭及上皮间质转化。3.高转移性肝癌细胞HCCLM3衍生的外泌体能够促进低转移肝癌细胞MHCC97L的肝内成瘤及肺转移。4.正常肝细胞和不同转移潜能肝癌细胞的外泌体拥有各自独特的蛋白质表达谱,肝癌细胞衍生的外泌体一定程度上能够反映肝癌细胞自身特征,肝癌外泌体中部分蛋白与肝癌预后不良密切相关,有望成为肝癌诊断筛查的潜在生物标志物。5.高转移性肝癌细胞HCCLM3衍生的外泌体中高度富集参与流体剪切力、氨基酸生物合成、抗原加工递呈、细胞碳代谢等生物过程的蛋白质,其中ENO1在肝癌细胞外泌体中高度表达,且随肝癌细胞转移能力增加呈递增趋势。6.肝癌细胞外泌体中ENO1的表达差异源于肝癌细胞本身,ENO1的表达与肝癌演进过程密切相关,高表达ENO1的肝癌患者生存期明显缩短。ENO1的表达与肝癌患者的TNM分期、Grade分级密切相关,且单因素和多因素分析提示ENO1的表达是影响肝癌患者生存的独立危险因素。7.敲降及过表达肝癌细胞中ENO1能够影响其衍生的外泌体中ENO1含量,但调控肝癌细胞中ENO1表达并不影响外泌体的分泌和被摄取。8.高水平的ENO1能够增强肝癌细胞的增殖和迁移侵袭能力,并促进细胞发生上皮间质转化。9.外泌体介导的ENO1能够增强低表达ENO1肝癌细胞的增殖和迁移侵袭能力,并促进其发生上皮间质转化。10.外泌体介导的ENO1能够促进低表达ENO1肝癌细胞的肺转移。11.敲降细胞中ENO1能够下调,而过表达细胞中ENO1能够上调整合素α6β4表达。12.外泌体介导的ENO1能够上调低表达ENO1肝癌细胞中整合素α6β4表达,激活整合素介导的FAK/Src-p38信号轴,进而促进肝癌的生长和转移。【结论】基于不同肝癌细胞转移潜能具有一定异质性,本研究发现高转移性肝癌细胞衍生的外泌体能够教化低转移肝癌细胞恶性转变,增强低转移肝癌细胞增殖和迁移侵袭能力,诱导低转移肝癌细胞发生上皮间质转化,并能够促进低转移肝癌细胞的肝内成瘤和肺转移。外泌体定量蛋白质组学分析表明,正常肝细胞及不同转移潜能肝癌细胞的外泌体蛋白质表达谱差异显著,肝癌细胞衍生的外泌体蛋白能够一定程度反映肝癌细胞自身特性。ENO1在肝癌细胞和组织中表达明显上调,在高转移肝癌细胞和转移组织以及高转移性来源的外泌体中表达更高,ENO1的表达与肝癌病程进展及恶化密切相关。机制研究表明,低表达ENO1的肝癌细胞摄取高表达ENO1肝癌细胞外泌体后,能够上调整合素α6β4表达,并激活整合素介导的FAK/Src-p38信号轴,从而促进肝癌细胞增殖、侵袭迁移及上皮间质转化,进而促进了肝癌的生长和转移。本研究证实,在肝癌演进过程中,不同分化方向产生的高低转移潜能肝癌细胞能够通过外泌体介导关键蛋白的交互作用促进肝癌生长和转移,为深入理解肝癌恶化过程,以改善肝癌的临床诊断和治疗提供了新思路。