微生物菌株因生长速度快,操作技术日趋成熟、便于扩大生产、环境友好、代谢终产物浓度高且易分离纯化等优点,而被认为是具有高经济附加值化合物异源合成的理想宿主。然而,目前的重组菌株在生产效率和产量上仍无法符合工业化生产的要求。与传统基于转录因子的代谢调控手段相比,近年报道的核糖开关对配体的响应更为快速,而且结构简单,便于改造。本研究以黄酮类化合物代谢的重要中间产物柚皮素为核糖开关的小分子配体,利用体外SELEX筛选获得能与柚皮素特异识别的适体库,进而以tetA双选择标记基因作为报告基因,在生物体内通过两条不同柚皮素浓度的筛选路径,富集获得具有不同最适检测适应范围的核糖开关库。经测序和柚皮素剂量响应测定证实,所得核糖开关的动态输出荧光激活率范围在1.68-2.77倍,MID系列核糖开关的线性响应范围约在5-100 mg L-1柚皮素,HIGH系列核糖开关的线性响应范围约在80-200 mg L-1柚皮素。本研究继而选用除柚皮素外的27种黄酮类化合物对6个人工核糖开关(M1、M2、M3、O、L、H3)进行平时筛选,以研究人工核糖开关的专一性识别特性,并根据各化合物的物理化学性质及其对应的绿色荧光激发强度,采用支持向量回归法的QSPR建模分析,对核糖开关M1、M2和O建立了具有良好预测能力的鲁棒性模型。通过对与模型呈高度相关的描述符分析知,核糖开关M1和M2有着非常类似的结构特点,其与配体分子结合的适体域应是一个富集正电荷的亲水性区域,该区域对配体分子中的脂肪酮结构具有特异性的识别,对C-3’和C-4’位羟基敏感。而核糖开关O的适体域却极有可能是一个单位体表面积比较小的疏水性区域,它与核糖开关L对多羟基黄酮类化合物的响应力更高。此外,实验结果还表明类黄酮分子结构中A环上的取代基团在核糖开关的激活过程中并不起主要作用。O-糖基化黄酮类衍生物可能受到空间位阻影响,对本研究中的人工核糖开关都不具激活作用。当前,研究人员对合成生物学代谢途径的设计与改造能力已远超所知筛选技术的筛选能力,设计验证的进程也因此被大大拖后。本研究应用上述人工合成RNA核糖开关,首次将共培养的概念应用于高通量筛选策略。本研究指出了影响人工核糖开关传感器性能的一系列关键操作参数,如核糖开关的启动子、核糖开关制动元件中的连接序列及其它会引起胞内RNA空间构象变化的因素、传感系统的宿主菌、发酵时间和培养基等。基于此,构建了双荧光标记的传感器模块(菌),实践了该模块与另一个柚皮素生物合成模块(菌)在共培养后,显示出绿色荧光激发强度与柚皮素产量间具有高度正相关性,建立了一种可信、快捷的高通量筛选方法。研究首次成功构建了具有生物活性的响应柚皮素的RNA核糖开关,评估了核糖开关的柚皮素剂量响应特性、动态检测范围和识别特异性等。尽管目前对RNA空间构象的检测手段还比较有限,但QSPR建模有助于阐明核糖开关-配体复合物结合过程中的理化结构特性。生物感应模块(菌)-代谢物合成模块(菌)共培养技术是对已有微生物共培养技术应用的拓展,并可以扩展到任何适宜的代谢物高通量筛选中。由于模块菌将负责生产的微生物和负责检测的微生物分割成各自独立的个体,从而省去了研究人员在后续模块优化等其它研究中需要更换或取出生物传感器的步骤。